發(fā)布時間：2024-04-09 14:40:32
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的分子生物學進展樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
關(guān)鍵詞：鉀離子通道；結(jié)構(gòu)；基因
離子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每個蛋白分子能以高達l08個／秒的速度進行離子的被動跨膜運輸，離子在跨膜電化學勢梯度的作用下進行的運輸，不需要加入任何的自由能。一般來講，離子通道具有兩個顯著特征：
一是離子通道是門控的，即離子通道的活性由通道開或關(guān)兩種構(gòu)象所調(diào)節(jié)，并通過開關(guān)應答相應的信號。根據(jù)門控機制，離子通道可分為電壓門控、配體門控、壓力激活離子通道。
二是通道對離子的選擇性，離子通道對被轉(zhuǎn)運離子的大小與電荷都有高度的選擇性。根據(jù)通道可通過的不同離子，可將離子通道分為鉀離子(potassium ion，k )通道、鈉離子(natrium ion，na )通道、鈣離子(calcium ion，ca2 )通道等。其中，k 通道是種類最多、家族最為多樣化的離子通道，根據(jù)其對電勢依賴性及離子流方向的不同，可把k 通道分為兩類：①內(nèi)向整流型k 通道(inward rectifier k channel；kin)，② 外向整流型k 通道(outward rectifier khannel；k out)。k 是植物細胞中含量最為豐富的陽離子，也是植物生長發(fā)育所必需的唯一的一價陽離子，它在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在k 通道，這一點早在20世紀6o年代植物營養(yǎng)學界就有人提出，而一直到80年代才被schroeder等人[23證實，他們利用膜片鉗(patch chmp)技術(shù)，首先在蠶豆(v／c／afaba)的保衛(wèi)細胞中檢測出了k 通道鉀離子通道的結(jié)構(gòu)單個鉀離子通道是同源四聚體，4個亞基(subunit)對稱的圍成一個傳導離子的中央孔道(pore)，恰好讓單個k 通過。對于不同的家族，4"亞基有不同數(shù)目的跨膜鏈(membrane。span。ning element)組成。兩個跨膜鏈與它們之間的p回環(huán)(pore helix loop)是k 通道結(jié)構(gòu)的標志2tm／p)，不同家族的k 通道都有這樣一個結(jié)目前從植物體中發(fā)現(xiàn)的k 通道幾乎全是電壓門控型的，如保衛(wèi)細胞中的k 外向整流通道等，其結(jié)構(gòu)模型如圖2一a所示。離子通透過程中離子的選擇性主要發(fā)生在狹窄的選擇性過濾器(selectivity filter)中(圖2一b)，x射線晶體學顯示選擇性過濾器長1．2 nill，孔徑約nill，k鉀離子通道的作用.有關(guān)k 通道在植物體內(nèi)的作用研究并不多。
從目前的結(jié)果來看，認為主要是與k 吸收和細胞中的信號傳遞(尤其是保衛(wèi)細胞)有關(guān)。小麥根細胞中過極化激活的選擇性內(nèi)流k 通道的表觀平衡常數(shù)km值為8．8 mmol／l，與通常的低親和吸收系統(tǒng)km值相似[ 。近年來，大量k 通道基因的研究表明，k 通道是植物吸收轉(zhuǎn)運鉀離子的重要途徑之一。保衛(wèi)細胞中氣孔的開閉與其液泡中的k 濃度有密切關(guān)系。質(zhì)膜去極化激活的k 外向整流通道引起k 外流，胞質(zhì)膨壓降低，導致氣孔的關(guān)閉。相反，質(zhì)膜上h．a(chǎn)tpase激活的超極化(hyperpolarization)促使內(nèi)向整流鉀離子通道(k in)的打開，引起k 的內(nèi)流，最終導致氣孔的張開鉀離子通道相關(guān)基因及其功能特征迄今，已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離得到多種k 通道基因(圖3)，根據(jù)對其結(jié)構(gòu)功能和dna序列的分析，可以把它們分為5個大組：工，ⅱ，ⅳ組基因?qū)儆趦?nèi)向整流型通道；m組屬于弱內(nèi)向整流型通道(weakly inwardakt1arabidopsis k transporter 1)是第一個克隆到的植物k 通道基因，采用酵母雙突變體互補法從擬南芥cdna文庫中篩選出來cdna序列分析表明，akt1長2 649 bp，其中的閱讀框為2 517 bp，編碼838個氨基酸殘基組成的多肽，相對分子質(zhì)量約為95 400 da。akt1編碼的k 通道，對k 有極高的選擇性，其選擇性依次是k >rb >>na >li 。
northern blot分析表明，akt1組織特異性較強，主要在根組織中表達zmk1(zea mays k channel 1)是從玉米胚芽鞘中分離出的k 通道基因，在皮層表達。在卵母細胞中的表達表明，zmk1編碼的k 通道是通過外部酸化激活的。有研究表明，藍光對zmk1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影響[3 2l。1組kat1組基因編碼內(nèi)向整流鉀離子通道，其與akt1組基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的最大區(qū)別是在cooh端沒有錨蛋白相關(guān)區(qū)(枷n—related do—main，anky)。kat1組基因主要包括kat1，kst1，sirk，kzm1，kpt1等。kat1(arabidopsis inward rectifier k channel1)是與akt1同時從擬南芥cdna文庫中篩選出來的植物k 通道基因。kat1基因的閱讀框含有2 031個核苷酸，編碼的多肽由677個氨基酸殘基組成，相分子質(zhì)量約為78 000 da。kat1的表達具有組織特異性，kat1在擬南芥植株中的主要表達部位是保衛(wèi)細胞，在根和莖中也有少量的表達。人們認為kat1通道可能參與了氣孔開放，并向維管組織中轉(zhuǎn)運k ，而不是直接從土壤中吸收kj。
以kat1為探針，又能從擬南芥cdna文庫中篩選出kat2等功能類似的內(nèi)向整流型k 通道基因通過基因工程技術(shù)，人們已相繼開展了將kati和akti基因?qū)说綌M南芥、煙草和水稻的研究，并獲得了一些轉(zhuǎn)基因植株。比如，施衛(wèi)明等利用根癌農(nóng)桿菌介導法已成功地把kat1和akt1導人擬南芥和野生型煙草中，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株及其純合株系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的吸鉀速率和對k 的累積能力都比對照的有明顯的提高，而且，經(jīng)過分子檢測，也證實711和akt1基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了整合和表達。因此，運用現(xiàn)代分子生物學手段和基因工程技術(shù)篩選高效利用鉀的作物品種或利用現(xiàn)有的鉀離子通道基因改良作物品種，從而提高作物本身的鉀吸收利用能力應該是目前主要的研究方向?？梢韵嘈牛S著分子生物學技術(shù)、基因工程技術(shù)和有關(guān)分析測試技術(shù)的發(fā)展和應用。隨著研究工作的不斷深入，有關(guān)鉀離子通道基因的分離、克隆和利用會取得更大的進展。
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迄今為止已發(fā)現(xiàn)和膽道腫瘤有關(guān)的癌基因有Ras（K－ras，N－ras）、c－myc、c－erbB－2、某些細胞因子及其受體、抗癌基因有P53、P16／MTS1、APC、DCC等。
1 癌基因
ras基因是一個常見的癌基因家族，由K－ras，N－ras，和H－ras三個成員構(gòu)成［1］。細胞中正常ras基因編碼高度相關(guān)的分子量為21000的蛋白質(zhì)（P21）。P21是一種鳥嘌呤核苷酸（GTP）結(jié)合蛋白，它由188或189個氨基酸組成，和細胞生長和分化密切相關(guān)。正常P21和GTP結(jié)合后激活磷脂酶C，產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），之后GTP被P21降解，第二信使便執(zhí)行使細胞分化和生長功能。若正常的ras基因發(fā)生了突變而變成了癌基因，其所編碼的變異P21蛋白仍能同GTP結(jié)合但是失去了降解GTP的功能，從而使磷酸脂酶C持續(xù)活化，產(chǎn)生大量IP3和DG，引細胞過度增殖，最終發(fā)生癌變［1］。
現(xiàn)在已在人類多種腫瘤中檢測到了ras基因突變［1］。40％的結(jié)腸癌，50％的肺腺癌，30％的急性白血病中均可檢測到ras基因的突變。其突變的作者單位：中國醫(yī)科大學第二臨床學院肝膽外科（沈陽110003）崔健現(xiàn)在上海醫(yī)科大學中山醫(yī)院肝癌研究所（200032）主要方式是點突變，12、13、61密碼子是突變熱點。在胰腺癌中K－ras基因的突變率高達90％以上，而且突變的位點大多局限于K－ras基因12位點上［2］。但是對于膽系腫瘤，關(guān)于ras基因突變研究文獻極少，而且結(jié)果差異很大，甚至還有完全相反的報道［3～5］。
almoguera應用RNA酶錯配切割法和DNA直接測序，分析膽道腫瘤的病理標本時，未見任何ras基因改變［2］。而Tada等應用DNA測序法研究膽囊癌和膽管癌標本發(fā)現(xiàn)肝外膽管癌中偶有ras基因突變，在膽囊癌中則不存在ras基因改變［3］。與之相反，Levi等的研究結(jié)果表明膽系腫瘤中存在著廣泛ras基因點突變［4］。他們認為以往文獻所報道的膽系惡性腫瘤中K－ras基因低突變率的原因不在于腫瘤細胞中真的不存在K－ras基因改變，而是檢測方法靈敏度不夠所致。DNA直接測序時，大約需要20％的細胞發(fā)生突變才能得到陽性結(jié)果，而RNA酶寡核苷酸錯配切割法的靈敏度則更低。他們認為，由于膽道腫瘤是多克隆發(fā)病，因而發(fā)生K－ras基因突變的細胞只是一小部分，用常規(guī)的實驗方法難以檢測出來。他們應用改良的兩步PCR－RFLP法（兩輪堿基錯配PCR＋兩輪限制性核酸內(nèi)切酶酶切）配以DNA直接測序，發(fā)現(xiàn)肝外膽管癌中K－ras基因突變率為100％。這種方法靈敏度非常高，可以在512個等位基因中檢測到一個基因的點突變。
watanabe等應用與Levi類似但更為簡便的方法檢測了20例膽道腫瘤的標本［5］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)55％的膽囊癌、100％的肝外膽管癌均存在K－ras基因改變。總的突變率為75％。絕大多數(shù)突變發(fā)生在第12位密碼子。常見的突變方式是GA，使GGT變成了GAT，所編碼的氨基酸也隨之由甘氨酸變成了天冬氨酸。少部分發(fā)生GGTGTT及GGTTTT改變，這些都導致了相應氨基酸改變，因而均是有意義突變。更為重要的是，他們發(fā)現(xiàn)一例膽囊腺瘤癌變的標本中，表面正常的腺瘤已經(jīng)發(fā)生了K－ras基因突變，而且突變方式和癌組織完全一樣，從而在基因水平上支持了膽囊腺瘤癌變的理論。
ajiki等的研究亦表明K－ras基因突變是膽道腫瘤中的一種普遍現(xiàn)象［6］。在他們的研究中，膽囊癌、膽管癌、膽囊上皮不典型增生的K－ras基因12位點的點突變率分別為57％、59％、73％。他們的實驗也發(fā)現(xiàn)了一個很有意義的現(xiàn)象：9例發(fā)生在膽囊癌周圍的不典型增生，都表現(xiàn)出了和膽囊癌相同的突變。因此他們認為在某些致癌因素（如：膽石、長期膽汁酸刺激等）的作用下，膽囊粘膜腸上皮化生膽囊粘膜不典型增生膽囊癌是膽囊癌的發(fā)病機制之一。
yukama 等應用免疫組織化學方法研究了慢性膽囊炎、早期膽囊癌和進展期膽囊癌中ras基因和其他癌基因產(chǎn)物的表達。發(fā)現(xiàn)早期膽囊癌中ras基因產(chǎn)物P21陽性表達率高達95％。膽囊炎為33％。其他癌基因產(chǎn)物如c－myc、c－erbB2、表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子受體（TGF－β）等在膽囊癌都有高表達，平均陽性率在60％左右。而在慢性膽囊炎中它們表達陽性率較低，平均在10％以下［7］。Lee等的研究結(jié)果也表明，與膽囊不典型增生和慢性膽囊炎相比，膽囊癌中P21呈現(xiàn)強表達，陽性率為62％，膽管癌中P21陽性率也達到了50％。P21表達和預后沒有明顯的關(guān)系［8］。以上學者都認為：膽囊癌發(fā)病過程中存在著多種基因共同作用，其中，ras基因突變可能是早期發(fā)生的事件之一。這與ras基因突變在結(jié)腸癌發(fā)病中的作用是類似的［9］。
c－erbB2癌基因所編碼產(chǎn)物是一種表皮生長因子受體（EGFR）類似物。對于它的研究結(jié)果不盡相同。Kamel等的研究結(jié)果表明膽囊癌中c－erbB2·35·肝膽胰外科雜志1999年第11卷第1期陽性率大約為10％。膽囊粘膜不典型增生中，其陽性率為0。他們認為c－erbB2表達在膽囊癌中是一較晚事件，只有在細胞癌變后才出現(xiàn)［10］。而Yukama等的研究表明c－erbB2在早期膽囊癌中陽性表達率為69％。在進展期膽囊癌中表達率為0。他們認為c－erbB2癌基因突變是膽囊癌發(fā)生早期事件之一［7］。出現(xiàn)這一不同結(jié)果的原因可能是：1．他們采用的方法、技術(shù)和對陽性率的規(guī)定不同。2．所選擇的膽囊癌是由完全兩種不同的致癌因素造成的。因此關(guān)于c－erbB2在膽囊癌發(fā)生中到底起何種作用，仍需進一步研究。
2 抑癌基因
關(guān)于抑癌基因，目前研究最多的是P53基因。P53定位于人染色體17P13，全長為16－20Kb，由11個外顯子構(gòu)成。正常P53基因編碼野生型P53蛋白，是一種分子量為53KD的核內(nèi)磷蛋白。人的P53蛋白由393個氨基酸組成。P53基因突變后所編碼的蛋白稱為變異型P53。
在人乳腺癌、腦瘤、結(jié)直腸癌、食管癌和肺癌中均已發(fā)現(xiàn)P53基因突變，總突變率為50％左右［11～13］。其中83％為錯義點突變，6％為無義點突變，10％為插入或缺失突變。P53的突變并非隨機發(fā)生，大多數(shù)的突變發(fā)生于133－299氨基酸。應用PCR技術(shù)研究后發(fā)現(xiàn)密碼子132－145、171－179、239－248、272－286為突變熱點。
野生型P53蛋白的主要功能是：抗細胞增殖，抑制細胞生長分裂，使細胞停止于G1期而不進入S期。野生型P53可以阻礙DNA復制起始復合物的裝配，抑制DNA復制，并且在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)節(jié)，防止細胞過度生長分裂。此外野生P53蛋白還可以誘導細胞分化。野生型P53基因失活的細胞經(jīng)久處于未成熟狀態(tài)，持續(xù)增生。突變型P53則不具備以上的功能。
野生型P53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期很短，而突變型P53則很穩(wěn)定，可以在核內(nèi)積聚，這使得可以用免疫組織化學方法檢測到它的存在［14］。突變型P53的檢測可以很好反映P53基因突變情況［15］。這一點不同于Ras基因。Wee等用S－P法研究了膽囊癌和肝外膽管癌中P53蛋白表達，陽性率分別為73％和64％［16］。他們認為在膽道癌發(fā)病過程中，P53基因突變是一個普遍發(fā)生的事件，是膽道癌發(fā)生內(nèi)在因素之一。Kamel［10］等的研究結(jié)果也表明在膽道癌中普遍存在著P53基因突變。更為重要的是，在兩例膽囊上皮不典型增生的標本中，他們也發(fā)現(xiàn)了P53蛋白陽性表達。
hanada等研究發(fā)現(xiàn)，在病理類型為平坦型的膽囊癌中，P53陽性率高于息肉型膽囊癌。而平坦型癌多為浸潤癌［17］。Roa的研究也表明，在早期膽囊癌中，P53的陽性率為23．5％，在進展期膽囊癌中，P53的陽性率達到48．2％。在高分化膽囊癌中，P53的陽性率為25％，而在低分化的膽囊癌中，P53的陽性率達到50％［18］。以上研究均提示P53高表達是腫瘤分化低、處于進展期、預后不佳的標志。
p16是近年發(fā)現(xiàn)的比P53更有力地引起正常細胞癌變的腫瘤抑制基因，又稱為多腫瘤抑制基因（MTS1）。P16基因定位于人染色體9P21，由三個外顯子構(gòu)成?？傞L度為8．5Kb。其編碼產(chǎn)物P16蛋白是細胞增殖周期的重要調(diào)節(jié)者和控制者［19］。它是細胞周期依賴性激酶4（CDK4）抑制因子。因而又稱M TS1／P16／CDK4。細胞進入分裂周期依賴于周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活化，CDK4和D型周期蛋白結(jié)合形成復合物能促進細胞從G1S期的轉(zhuǎn)變，從而促進細胞增生，這可能是惡性腫瘤發(fā)生因素之一。P16蛋白能和CDK4結(jié)合，抑制細胞轉(zhuǎn)化。近年來有關(guān)P16基因純合性丟失的研究表明，在人類大部分腫瘤中，均有P16純合性丟失，與雜合性丟失一起，總的突變率為50％。堿基突變和缺失另占25％，故在腫瘤組織中P16總突變率為75％，比P53的50％的突變率高得多。
1995年，Yoshida等人世界上首次報告了P16基因在膽道腫瘤中的突變情況［20］。他們分析了25例膽道腫瘤標本和4個膽系腫瘤細胞株后發(fā)現(xiàn)原發(fā)膽道腫瘤中P16／MTS1的總突變率為64％（其中膽囊癌80％，膽管癌63％），高于P53突變率。他們認為在膽系腫瘤發(fā)生中，P16可能比P53起更重要的作用。但是P16在膽系腫瘤中到底作用如何，具體突變方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一個明確結(jié)論。
aPC基因和DCC基因是通過對大腸癌研究在人5號染色體上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，編碼產(chǎn)物分子量超過300，000，調(diào)控ras基因表達。后者也位于5q21，在APC附近。關(guān)于他們在膽道腫瘤的研究較少。雖然已在2個人類膽管癌細胞株中發(fā)現(xiàn)有5號染色體改變［21］，但應用多種基因探針雜交未發(fā)現(xiàn)在肝內(nèi)膽管癌中有5q［21，22］缺失，故認為APC和DCC與膽管癌關(guān)系不大［22］。
3 前景和展望
雖然對于膽系腫瘤的分子生物學研究與胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌相比仍不夠深入，眾多的問題還有待于解決，但是目前的研究結(jié)果大大豐富了我們對于膽系腫瘤的認識，這對于尋找早期診斷膽系腫瘤的有效手段具有重要的指導價值。
膽道腫瘤發(fā)病率近年明顯上升。由于早期診斷困難，故預后極差。尋找一條有效的早期診斷手段是當前研究的重要課題。從胰腺癌的研究中我們可以獲得一些啟發(fā)。1990年Shibata對36例胰腺癌標本作細胞學檢查的同時作K－ras基因突變分析，結(jié)果25例細胞學檢查惡性標本中18例測到了ras基因點突變［23］。3例細胞學檢查良性標本無一例發(fā)生ras基因突變。8例細胞學檢查為不典型增生標本中，有兩例發(fā)生突變。1991年，Tada等對B超引導下胰腺穿刺所獲得的細胞進行基因分析，檢測K－ras基因12位點的突變，成功地為2例細胞學檢查無法判定病變良惡性的病例作出了診斷［24］。隨著研究方法的不斷改進，特別是改良的二步PCR－RFLP方法的應用，人們發(fā)現(xiàn)膽道腫瘤中也廣泛存在著K－ras基因12位點的突變，總突變率在75％～100％之間，接近于胰腺癌突變水平。由于PCR技術(shù)靈敏性和特異性極高，可以從幾個拷貝的DNA分子中檢測到K－ras基因點突變，因而用十二指腸引流或PTCD檢查獲得膽汁中的脫落細胞，或在B超引導下用細針穿刺膽道腫瘤獲得標本，然后用PCR法檢測標本中K－ras基因12位點突變，有可能開創(chuàng)一條早期診斷膽道腫瘤的新途徑，而且對于常規(guī)影像學和細胞學檢查有重要補充價值。
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非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以無過量飲酒史(酒精攝入量＜20 g/d)以及肝細胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉輕度炎癥和(或)肝中央靜脈、肝竇周圍膠原沉積等為臨床病理特點的慢性肝臟疾病［1］，它包括單純性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcohlic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝硬化(fatty liver cirrhosis，F(xiàn)LC)三種類型。NAFLD已成為導致轉(zhuǎn)氨酶異常的首要病因，并且有部分患者進展到終末期肝病，部分患者甚至與肝臟腫瘤有關(guān)。目前我地區(qū)NAFLD的發(fā)病正在逐漸上升［2］，本病的發(fā)病原因尚不完全清楚，認為其發(fā)生與胰島素抵抗、氧應激反應和脂質(zhì)過氧化物質(zhì)的代謝失衡有關(guān)［3］。本文就該病近幾年來其分子生物學方面的一些研究進展綜述如下。
1.氧自由基對肝細胞的損害作用
患者由于甘油三脂在肝細胞內(nèi)蓄積，大量的游離脂肪酸（FFA）在線粒體內(nèi)氧化，產(chǎn)生了過多的超氧陰離子和活性氧物質(zhì) (reactive oxygen species，ROS)，使抗氧化物質(zhì)耗竭，過量的過氧化氫 (H2O2)和氫氧根離子 (OH)損傷肝臟細胞的線粒體和細胞膜，使肝細胞正常生長停滯，炎癥變性，最終導致肝細胞變性壞死而引起臨床癥狀［4］。氧是生物維持活性的必要元素，但其在代謝過程中形成的中間產(chǎn)物ROS，與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多價不飽和脂肪酸及核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，結(jié)果使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生障礙，引起細胞功能失調(diào)甚至破裂、死亡。機體在正常生理狀態(tài)下，具有完善的抗氧化機制，包括超氧化物歧化酶(SOD)等酶類和谷胱甘肽(GSH)等非酶類活性氧清除劑?，F(xiàn)代研究認為，活性氧增多和活性氧清除劑減少是NAFLD的重要發(fā)病機制［5］。線粒體是脂肪酸進行β氧化和三羧酸循環(huán)、ATP合成和ROS形成的主要場所，線粒體在氧化脂肪和其他燃料供給大多數(shù)細胞 ATP時，快速形成 ROS，盡管在這一過程中部分電子可與呼吸鏈上的半醌自由基反應形成超氧陰離子(O2)、過氧化氫 (H2O2 )和氫氧根離子 (OH)等氧自由基，其中超氧陰離子是最重要的毒性氧類產(chǎn)物，但細胞內(nèi)的抗氧化劑可以清除之，避免其所致的氧化應激和脂質(zhì)過氧化［7］。線粒體是 ROS形成的主要部位，線粒體電子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可消耗細胞90％的氧。大量的ROS可直接或間接通過改變線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔 (MPTP)的開關(guān)，導致細胞凋亡和壞死［8］。 ROS可氧化不飽和脂肪酸導致脂質(zhì)過氧化，所形成的脂質(zhì)過氧化物 (LPO)可使部分非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者發(fā)生 mtRNA缺失、復制錯誤、修復障礙和斷裂，并造成其呼吸鏈復合物活性降低［4］。DNA對氧應激很敏感，線粒體的DNA(mtRNA)的氧化損傷敏感性比核DNA高達10～16倍，這是由于mtRNA缺乏組蛋白保護、線粒體修復程序不完整以及 mtRNA相似呼吸鏈(該鏈是細胞內(nèi) ROS的主要來源)的缺乏［6］。研究發(fā)現(xiàn)，大部分NAFLD患者的大部分肝臟 mtRNA均有缺損，造成呼吸鏈復合物活性降低，同時，線粒體缺乏過氧化氫酶，該酶是唯一作用于GSH過氧化氫毒性作用的酶，線粒體不僅是氧應激的源頭，而且是 ROS作用的靶，大量的ROS促成線粒體功能障礙［8］。LPO還可與線粒體蛋白反應形成復合物，抑制電子沿著呼吸鏈的傳遞，使氧自由基形成顯著增多，進而加重線粒體損傷［6］。
2.腫瘤壞死因子(TNFα) 與NAFLD
機體的氧應激反應產(chǎn)生過多的TNFα可以誘導肝臟成纖維細胞、平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生集落刺激因子(GMCSF)，從而影響機體的炎癥反應和脂質(zhì)代謝［9］。TNFα與早期非酒精性脂肪性肝病損傷有密切關(guān)系。有報道，NAFLD患者循環(huán)中TNFα水平增高，且TNFα與肝臟損傷的生化指數(shù)相關(guān)［10］。人們應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應在大鼠非酒精性肝病模型的研究中發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)TNFα mRNA增高的水平與肝臟病理損傷的程度相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)，抗TNFα抗體可以明顯減輕非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝臟炎癥和肝細胞壞死病變，但對肝脂肪變性無影響［11］。對離體人肝胚細胞瘤細胞進行細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)，TNFα可以使該細胞生存力下降，這種作用與TNFα抗體引起細胞凋亡有關(guān)，抗TNFα抗體可以減輕TNFα的細胞毒性作用［12］。以上研究說明，TNFα在NAFLD的發(fā)病中起一定作用。
3.白介素(Interleuldn，IL) 與NAFLD
近年來有研究表明，不同的枯否氏細胞的功能狀態(tài)可加重或減輕NAFLD的肝損傷，因此認為其在NAFLD的發(fā)病中起重要作用，為此，枯否氏細胞的功能狀態(tài)在NASH發(fā)病機制中的作用也日益受到關(guān)注。人們發(fā)現(xiàn)NAFLD不但循環(huán)中 ILla和 IL6水平顯著增高，而且兩者的濃度與肝臟損傷的嚴重程度呈高度相關(guān)趨勢［13］。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠過量的脂肪灌胃2周或 4周，其肝臟內(nèi) ILla mRNA水平增高。喂飼過量的脂肪16周的大鼠肝內(nèi)枯否氏細胞產(chǎn)生的 IL6 mRNA水平較對照組增加4倍。因此認為NAFLD中ILla和IL6的增高可能與 ILla、IL6轉(zhuǎn)錄水平增高有關(guān)［14］。IL6可以刺激培養(yǎng)的人皮膚纖維母細胞合成膠原。有人發(fā)現(xiàn)，枯否氏細胞 IL6 mRNA表達的增高與NAFLD纖維化形成有關(guān)，提示NAFLD中枯否氏細胞起源程序 IL6可能有促進膠原形成的作用［13］。另外，離體的 ILla、IL6細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)，單獨或聯(lián)合將 ILla或(和)IL6作用于肝炎細胞不會引起細胞毒性反應［14］。目前，關(guān)于 ILla、IL6在NAFLD發(fā)病中的作用途徑還在研究中。
4.轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)與NAFLD
TGFβ廣泛存在于哺育動物所有組織中，以血小板和骨組織中表達水平最高。在人體內(nèi)存在 TGFβ1、2、3三種異構(gòu)體。TGFβ起著調(diào)節(jié)細胞生長和分化的作用［15］。NAFLD患者，肝內(nèi)TGFβ主要來源于枯否氏細胞。目前認為，TGFβ在NAFLD的主要作用是通過誘導細胞外基質(zhì)的形成，抑制細胞外基質(zhì)降解，導致肝纖維化形成［16］。從脂肪性肝纖維化大鼠肝臟分離得到的枯否氏細胞作用于肝星狀細胞，可以發(fā)現(xiàn)肝星狀細胞產(chǎn)生膠原。為了進一步證實TGFβ的作用，將抗TGFβ IgG預先與枯否氏細胞一起培養(yǎng)，然后去除多余的IgG，此時枯否氏細胞刺激肝星狀細胞產(chǎn)生膠原的作用被抑制，表明脂肪性肝損傷中枯否細胞產(chǎn)生TGFβ是促進膠原形成的重要細胞因子［17］。另外，離體培養(yǎng)的肝竇內(nèi)皮細胞上的受體可與TGFβ快速結(jié)合。肝竇內(nèi)皮細胞上這種高親和力受體的存在可能是TGFβ作用的重要途徑［18］。研究顯示，增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體，停滯于G1／S期的肝竇內(nèi)皮細胞數(shù)量與NAFLD的嚴重程度明顯相關(guān)。TGFβ通過與肝竇內(nèi)皮細胞受體結(jié)合抑制其增殖，使其分化為平滑肌樣細胞，后者在肝纖維化中起一定的作用。肝竇內(nèi)皮細胞增殖抑制還可能通過產(chǎn)生另一些中間介質(zhì)刺激肝星狀細胞分泌細胞外基質(zhì)。人體內(nèi)三種形式的TGFβ在NAFLD中均增高，并且隨病變嚴重程度而增加，其mRNA表達水平明顯增高。肝內(nèi)TGFβ二聚體具有生物活性，還原劑可使二聚體分離，活性完全喪失，酸性微環(huán)境對于激活TGFβ有著重要意義。枯否氏細胞可能首先分泌非活性TGFβ，后者在細胞外或靶細胞表面激活，轉(zhuǎn)化為活性形式的TGFβ而發(fā)揮作用［19］。
此外，本病還受遺傳、環(huán)境、免疫和藥物等因素影響，總之，NAFLD的發(fā)病機制具有多樣性，仍有廣闊的研究空間。我們堅信隨著對本病研究的不斷深入，其發(fā)病機制將會得到進一步的闡明，并為其有效的防治提供措施。
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關(guān)鍵詞：合成類高分子材料 生物可降解 藥物載體 生物醫(yī)學
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.066
【中圖分類號】R-0 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2013）08-0070-02
生物可降解高分子材料在主鏈上一般含有可以水解的基團，如酯、酸酐、碳酸酐、酰胺或氨酯鍵等，在活體環(huán)境中，這些基團可以通過簡單的化學反應或者酶催化作用而降解[1]，降解產(chǎn)物為水、二氧化碳等小分子，從而能夠被生物體代謝、吸收或排除，對人體無毒無害，而且這類材料具有良好的生物相容性和親和性，物理化學性質(zhì)可調(diào)節(jié)等優(yōu)點，可用于受損生物體組織和器官的修復、重建以及藥物載體材料。
1 生物可降解高分子材料的分類
生物可降解高分子材料按其來源可以分為天然的和合成的兩大類。天然的可降解高分子如殼聚糖、明膠、纖維素、淀粉等，因具有良好的生物相容性和可降解特性而被廣泛用作藥物載體材料[2]。Hejazi等[3]用化學交聯(lián)的方法制備的四環(huán)素-殼聚糖微球，研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)PH改變微球中谷氨酰胺帶電性質(zhì)，可實現(xiàn)藥物的靶向釋放。淀粉微球在鼻癌治療中的應用也越來越引起關(guān)注[4]。明膠是動脈栓塞療法治療腫瘤的常用天然基質(zhì)材料。近年來研制的抗腫瘤明膠微球如甲氨蝶呤明膠微球、羥基喜樹堿明膠微球等，研究證明其治療效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)給藥方法，且理化性質(zhì)穩(wěn)定。然而，天然高分子大多具有熱塑性差、成型加工困難、耐水性差，單獨使用時性能差等缺點，應用中受到很多限制。
2 合成類高分子材料的分類
2.1 生物合成類高分子材料。合成類高分子材料可分為生物合成和化學合成降解高分子。生物合成可降解高分子主要是由微生物或酶合成，如聚羥基烷酸酯（PHAs），其具有良好的生物相容性，已被應用于藥物載體、手術(shù)縫合線、植入材料、骨夾等生物醫(yī)學裝置。但是PHAs力學強度差、降解過慢，適合長期植入材料，為了滿足實際要求，往往將不同種類的PHAs按一定比例共混，調(diào)節(jié)材料的強度和降解速度。Hu等[5]制備了PHAs類聚酯的三元共聚物，研究發(fā)現(xiàn)其具有較粗糙的表面，親水性優(yōu)于PLA等，材料表面的骨髓基質(zhì)細胞生長量和成骨性都優(yōu)于其它PHAs類聚酯。然而這種材料價格較為昂貴，限制了它的臨床推廣。
2.2 化學合成類高分子材料。
2.2.1 脂肪族聚酯類?；瘜W合成的可降解高分子材料主要有聚酯類、聚碳酸酯、聚氨酯類和聚酸酐類等。脂肪族聚酯類是目前研究最多、應用最廣的生物可降解合成高分子，常見的有聚乙交酯（PGA）、聚丙交酯（PLA）、聚己內(nèi)酯（PCL）及其共聚物，它們具有良好的生物相容性、成膜性好、化學穩(wěn)定性高、降解產(chǎn)物無毒無害、降解速度和物理化學性能可以通過調(diào)節(jié)聚合物組分、組成比例和分子量來實現(xiàn)，其單體大部分來源于植物、石油、天然氣等再生資源，因此成為目前應用最廣泛的合成類生物降解高分子材料[6]。聚乳酸（PLA）材料韌性差且降解慢，而PGA力學強度大，加工成型難度大，降解速度快，所以兩者共聚可以取長補短，通過調(diào)節(jié)兩組分比例和分子量改變共聚物的特性來滿足實際應用要求。有時也會加入其它的聚合物來改善共聚物的性能，如把親水性的聚乙二醇（PEG）（B段）插入到PLGA、PCL、LA或GA（A段）的鏈段中，形成溫度敏感型嵌段共聚物ABA或BAB類型，用于調(diào)節(jié)共聚物的親水性和降解速度。Ruan等[7]合成了PLA-PEG-PLA嵌段共聚物，并作為水溶性抗癌藥物紫杉醇的藥物載體，研究表明PEG的加入提高了聚合物的親水性和釋藥速率。
2.2.2 聚磷酸酯類。聚磷酸酯類最近幾年報道較多，在生物醫(yī)學、塑料工業(yè)、飼料行業(yè)等都有應用，但在藥物控釋領(lǐng)域研究尤為突出。主要原因有三[8]，其一，聚磷酸酯中的五價磷原子結(jié)構(gòu)使其更容易被修飾和功能化，可直接接枝藥物分子或活性分子；其二，磷酸酯類大量存在于人體內(nèi)，而且是細胞膜的主要組成之一，因此聚磷酸酯類在生物體內(nèi)具有很好的細胞親和性和細胞膜通透能力，而且易被水解和被酶分解；其三，腫瘤細胞內(nèi)磷酸酯酶和磷酰胺酶等的含量和活性都高于正常細胞，聚磷酸酯載藥微粒易被分解而釋放藥物，達到靶向釋放的目的。因此，聚磷酸酯作為抗腫瘤藥物的載體越來越受到重視。具有提高人體白細胞作用的茜草雙酯和磷酰二氯縮聚反應合成的聚磷酸酯，可以作為抗腫瘤藥物5-Fu的載體，降解釋放的茜草雙酯和5-Fu可達到治療癌癥放化療引起的白細胞減少癥和抗癌的雙重功效[9]。Wang等人[10]用含陽離子的聚磷酸酯與其他聚合物合成三嵌段共聚物納米膠束，作為帶負電的小干擾RNA的基因載體，可較好的沉默細胞異性蛋白的表達。聚磷酸酯在組織工程領(lǐng)域也引起越來越多的關(guān)注。聚磷酸酯與對苯二甲酸乙酯的共聚物，可作為神經(jīng)導管材料，生物相容性好，有利于神經(jīng)再生長[11]。
2.2.3 聚氨基酸類。聚氨基酸具有很好的生物相容性和可降解特性，無毒無害，已廣泛應用于藥物載體、組織工程材料等生物醫(yī)學領(lǐng)域。但因其降解性能難控，實際應用中常通過與其他化合物共聚，改變各組分比例、分子量等手段得到具有新特征的材料，如聚賴氨酸-聚乙二醇共聚物、聚天冬氨酸-聚乙烯醇共聚物、聚谷氨酸-氧化硅接枝共聚物、聚氨基酸-聚乳酸共聚物等。目前，研究最熱的是聚氨基酸-聚乳酸共聚物。聚乳酸具有親水性差、細胞親和性不理想、結(jié)晶度高、降解慢的缺點，對聚乳酸的改性成為研究的重點。聚氨基酸含有羥基、氨基、羧基等多個活性官能團，可以固定蛋白質(zhì)、多肽等生物活性因子，將聚氨基酸與聚乳酸共聚，不僅可以改善聚乳酸的親水性、細胞親和性和降解速度，還可以引入活性基團。葉瑞榮[12]等人用直接熔融法合成聚（乳酸-甘氨酸）和聚（乳酸-天冬氨酸），研究發(fā)現(xiàn)，改性后的聚乳酸為無定型態(tài)，結(jié)晶度降低，親水性和降解速度均提高，可作為藥物緩釋材料。嚴瓊姣等人[13]用3S-[4-（芐氧羰基氨基）丁基]-嗎啉-2，5-二酮和丙交酯共聚，制備了RGD多肽接枝聚（乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸）共聚物，RGD修飾后的共聚物具有很好的神經(jīng)細胞親和性和親水性，可作為神經(jīng)修復支架材料。
2.2.4 聚碳酸酯。聚碳酸酯是一類環(huán)境友好型和生物相容性較好的高分子材料，因主鏈和側(cè)基的不同而種類繁多，可通過引入功能化側(cè)基（如羧基、羥基、氨基、雙鍵等）和化學設計分子主鏈等方式，改變其親水性、降解速度和熱力學性能，同時還可以接入多肽、抗體等活性基團。近年來在藥物控釋系統(tǒng)、手術(shù)縫合線、骨固定材料等領(lǐng)域應用越來越廣泛。聚碳酸酯根據(jù)主鏈結(jié)構(gòu)的不同，可分為脂肪族聚碳酸酯和含芳香族主鏈的聚碳酸酯。聚碳酸三亞甲基酯（PTMC）是最常見、研究最多的線型脂肪族聚碳酸酯，在體內(nèi)生物酶的作用下可加速其降解[14]。聚碳酸酯可通過引入功能化側(cè)基、物理共混和化學共聚的方法進行改性。Zhuo等[15]以甘油為起始原料合成了主鏈含有羥基的聚碳酸酯，研究證明該聚合物具有較好的生物相容性，羥基的引入改善了聚合物的親水性和降解特性。Albert-stson等[16]制備了以PTMC為載體的阿米替林釋藥模，但是藥物釋放速度很慢，通過PTMC與一定量的聚酸酐共混，可明顯提高阿米替林的釋放速度。商品名為Maxon的生物可吸收手術(shù)縫合線就是由32.5%（摩爾比）的TMC與GA共聚得到的Poly（GA-co-TMC），該聚合物具有很好的彈性，彌補了PTMC降解速度慢的缺點[17]。
2.2.5 聚酸酐類。聚酸酐類最早由Bucher和Slade在1909年合成。直到八十年代，人們發(fā)現(xiàn)它的易水解特性才將其應用到藥物緩釋體系中。聚酸酐具有以下特點：①表面溶蝕的降解特性。其在人體內(nèi)的藥物釋放接近零級釋放，且無藥物暴釋現(xiàn)象。②降解速度可調(diào)節(jié)?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)共聚物的組成、組分比例和分子量等調(diào)節(jié)降解速度和藥物釋放速度。③具有良好的生物相容性，對人體無毒害作用。④在藥物釋放領(lǐng)域具有良好的藥物穩(wěn)定作用。目前，用聚酸酐局部控制給藥體系治療實體瘤癌癥已引起高度重視，成為研究的熱點。美國FDA已批準其用于復發(fā)惡性腦瘤的輔助化療。
3 應用和發(fā)展趨勢
目前，合成類生物可降解高分子材料在藥物控釋體系、組織工程、手術(shù)縫合線、超聲造影等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注和應用。在藥物控釋領(lǐng)域，根據(jù)作用部位不同，可加工成微球、纖維、片劑、膜、棒、納米乳和亞納米乳等。為了提高藥物的靶向性，納米顆粒和磁性納米顆粒成為研究的熱點。單個的聚合物材料因自身缺點往往不能滿足生物醫(yī)學的要求，常與其他高分子共聚、共混或引入活性官能團，通過改變各組分配比、分子量、制備方法和條件等因素，或?qū)?cè)基進行功能化修飾，制備出符合現(xiàn)實要求的、兼顧各自優(yōu)點的新型高分子材料。當然，新型材料制備的經(jīng)濟成本和工藝實現(xiàn)工業(yè)化等問題也應引起重視。未來，合成類生物可降解高分子材料在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用會越來越廣闊。
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分子生物學的專業(yè)術(shù)語眾多、基礎(chǔ)理論較抽象，盡管已有相關(guān)理論課程講授，但是筆者發(fā)現(xiàn)在實習中，仍有相當多的學生存在基本概念不清、基本原理模糊等問題。因此在臨床實習階段，帶教教師必須幫助醫(yī)學檢驗專業(yè)學生進一步理解和掌握分子生物學理論知識。
1.1基礎(chǔ)知識的強化講解
在臨床實習階段，對于學生基礎(chǔ)知識的強化講解不能是簡單的教材重復講授，講授內(nèi)容的選擇要有針對性和實用性。因此，筆者選擇常用的分子生物學臨床檢驗項目為實例，采取小組討論的形式，鼓勵學生大膽提問和自由討論，將實驗涉及的專業(yè)術(shù)語和基礎(chǔ)理論進行再次講解。例如，筆者以檢驗項目乙型肝炎病毒DNA定量和基因分型檢測實驗為討論對象，在DNA提取過程中向?qū)W生介紹核酸分子的特性;在PCR擴增時詳細講解聚合酶鏈反應的條件、過程和特點;在檢測狀病毒基因型時講解核酸分子雜交的基本原理等。在基礎(chǔ)知識講授的過程中，將枯燥的專業(yè)術(shù)語和抽象的基礎(chǔ)理論融入一個個具體的臨床檢驗實例，由臨床問題引出要掌握的基本概念和基本原理，極大的提高了學生學習理論的興趣、改善了理論教學的效果。筆者通過實習階段對學生的強化講解，使學生能夠切實掌握在臨床分子生物學實驗室中開展工作所必備的基礎(chǔ)知識。
1.2前沿知識的擴展講授
由于教材一般都滯后于學科的發(fā)展，并且教材的編寫通常更加注重知識的廣泛性而非深入性，因此相當部分的分子生物學新進展未能在理論課程中講授川。而在臨床實驗室中，越來越多的分子生物學新技術(shù)已在臨床運用，為了彌補分子生物學教材和臨床實際脫節(jié)的缺陷，筆者在醫(yī)學檢驗專業(yè)學生臨床實習期間，采用專題學習的方式，針對性的講解分子生物學檢測的新進展和新技術(shù)。例如，在學生已掌握聚合酶鏈反應基本原理的基礎(chǔ)上，更加深入的介紹臨床和科研工作中常用的R子PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR等衍生擴增技術(shù)的相關(guān)原理和特性。
對于基因芯片檢測、高分辨溶解曲線分析等最新的分子生物學技術(shù)，也以專題講座的方式，結(jié)合臨床和科研的實際運用現(xiàn)狀向?qū)W生進行深入淺出的講解，并且鼓勵學生廣泛閱讀文獻和參考資料。在實習期間，實際操作中還會安排有興趣的學生參加院內(nèi)、市內(nèi)和省內(nèi)舉辦的各種分子生物學新技術(shù)繼續(xù)教育培訓，使醫(yī)學檢驗專業(yè)學生能夠了解最新的學科進展。通過上述多種方式，培養(yǎng)學生自主學習知識的興趣和能力。
2培養(yǎng)實踐動手能力
分子生物學技術(shù)的種類繁多、發(fā)展迅速，學生在校學習期間，僅僅依靠有限的教學設備和較短的實驗課時是無法掌握分子生物學的基本技術(shù)。臨床分子生物學實驗室通常都具有較為完備的實驗器材和檢測設備。因此，在實習期間，如何充分利用上述有利條件，培訓醫(yī)學檢驗專業(yè)學生的實驗技能也是分子生物學實習教學的一個重點川。
2.1基本實驗技能的培訓
學生在進入臨床實驗室實習后，對很多實驗器材、精密設備比較陌生，實際操作中往往存在很多不規(guī)范的環(huán)節(jié)川。筆者必須從檢測樣本的離心、移液器的使用、反應液的混勻等最基本的實驗操作出發(fā)，細致的講解各項操作過程，讓學生掌握每一步的操作規(guī)范，重點強調(diào)操作要點和關(guān)鍵步驟，通過示范性操作和一對一指導，由易到難，帶領(lǐng)學生認真完成每一項實驗操作內(nèi)容，使每位學生都能夠熟練的掌握各種操作的具體步驟和注意事項。并且在臨床實際工作中，教師必須做到“放手不放眼”，對學生持續(xù)關(guān)注、嚴格要求，以培養(yǎng)學生良好的實驗習慣和嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L。以病毒核酸提取的培訓為例，筆者要求學生在理解提取原理的基礎(chǔ)上，掌握提取操作的流程，熟悉操作的要點和關(guān)鍵步驟，并且能夠分析影響實驗結(jié)果的相關(guān)干擾因素。在學生的臨床實習期間，通過多種和大量的實際操作，使學生掌握臨床檢測和科研工作中常用的分子生物學技術(shù)，培養(yǎng)醫(yī)學檢驗專業(yè)學生基本的工作能力困。
2.2科研項目的教學轉(zhuǎn)化
臨床分子生物學實驗室承擔的不僅僅是臨床檢測任務，還包括部分的科研任務。筆者在申報各級科研課題的過程中，鼓勵學生大膽參與查閱文獻、凝練科學問題、實驗設計、撰寫標書等各個方面工作，學生通過文獻的閱讀、搜集和分析能夠鞏固基礎(chǔ)理論知識，了解最新研究進展;通過科學問題的凝練能夠培養(yǎng)學生的獨立思考能力;學生通過實驗設計能夠熟悉各種實驗方法;通過撰寫項目標書能夠極大的提高學生的科研寫作水平。筆者也鼓勵學生在教師的指導下積極參與多項科研項目，以提高學生的實驗觀察能力和強化學生的獨立操作能力?？蒲泻徒虒W的相互滲透、相互轉(zhuǎn)化不僅豐富了分子生物學實習教學的內(nèi)容，而且拓展了學生的思維、提高了學生的綜合素質(zhì)，激發(fā)了學生的科研能力和創(chuàng)新精神，幻。
關(guān)鍵詞 工科院校 分子生物學實驗 改革
中圖分類號：G640 文獻標識碼：A
On Biological Students' Individualized Practice
Education in Engineering College
――Take Molecular Biology Laboratory as an example
XIE Hui， SHEN Xiaomin
（School of Life Science and Technology， Xidian University， Xi'an， Shaanxi 710126）
Abstract In this paper， the author of the engineering colleges features， combined with years of experience in the course professor of molecular biology experiments， analysis of some of the drawbacks of traditional molecular biology lesson exist now leads aspects of molecular biology experiment teaching system in need of reform. Try to open innovation experiments， increasing the comprehensive design experiment， the introduction of the experimental research of teachers and teaching aspects reforms to achieve significance in molecular biology experiment teaching.
Key words engineering college； molecular biology experiment； reform
1 工科院校分子生物學實驗教學存在的問題
1.1 課時緊張，實驗項目大同小異
分子生物學實驗課廣泛存在于全國多數(shù)具有生命科學學院的專業(yè)實驗課程中，一般均為專業(yè)必修實驗課程。但由于多數(shù)工科院校對于理科課程分配的課時有限， 如本校分子生物學實驗課程學期課時僅30學時。因此，教師要在有限的時間內(nèi)達到大綱規(guī)定的培養(yǎng)目標和要求就直接導致了傳統(tǒng)分子生物學實驗教學內(nèi)容上往往是選擇一些基礎(chǔ)實驗進行講授。這樣實驗課程往往成了走過場，使得學生不能真正認識到分子生物學實驗在他們專業(yè)領(lǐng)域中的實際作用，進而會嚴重影響學生對分子生物學實驗的學習積極性和學習興趣。
1.2 壓制學生的創(chuàng)造性
現(xiàn)在高校中絕大多數(shù)學生均為90后，由于接觸到更多的新事物，他們對于事物的認知和渴望是非常強烈的。但是在傳統(tǒng)分子生物學實驗教學過程中，很多內(nèi)容都是由實驗教師提前做好充分的準備，學生進入實驗室一般只會做一些老師設定好的簡單操作就可以完成整個實驗，對于很多重要實驗原理具體技術(shù)路線，實際應用均不知曉。這樣機械化的實驗教學形式，不能激發(fā)現(xiàn)代大學生對實驗動手操作的興趣， 同時會影響他們對分子生物學實驗教學的積極性，更為嚴重者還會導致學生對自己所學專業(yè)的失望。
2 個性化分子生物學實驗教學改革分析
2.1 針對工科實踐性特點安排實驗
由于本校是一所工科院校，多數(shù)學生最終都要進入生產(chǎn)第一線，因此，一方面我們申請增加了分子生物學實驗課程課時量，另一方面我們增加了分子生物學技術(shù)在尖端科研、疾病檢測及環(huán)保領(lǐng)域應用的創(chuàng)新性、綜合性實驗，使學生能夠直觀地了解到自己所學的知識及實驗技能能夠?qū)W以致用。整個實驗課教學體系分為三個主要部分進行：第一部分為五個基本實驗，是所有學習分子生物學的工科學生必須掌握的最基本的基礎(chǔ)實驗技能，其中包括三個核酸提取實驗、一個電泳檢測實驗、一個PCR反應實驗。第二個部分為分子生物學基本實驗技能應用、提高的實驗內(nèi)容，包括學生選做的三個實驗。這些實驗的目的在于培養(yǎng)學生能夠應用分子生物學的基本實驗技能解決一些實際問題，例如：聚合酶鏈式反應對疾病的檢測、引物設計合成和功能性基因擴增、分子生物學方法高精度檢測環(huán)境微生物種類及分布。第三個部分為綜合性、設計性實驗，主要是針對學生的不同特點，分組選擇課題進行研究，完成后撰寫并提交研究報告，該部分主要是學生根據(jù)所學知識和技能自主進行完成。
2.2 設立分子生物學實驗開放性實驗
首先在分子生物實驗課程中嘗試了開放式的教學模式，包括實驗內(nèi)容的開放（分子生物學實驗教學改革中第三個部分的綜合性、設計性實驗）及實驗時間的開放。在分子生物實驗教學內(nèi)容中，第三部分的內(nèi)容為開放式的，學生可以根據(jù)自己的專業(yè)方向、興趣自主選擇研究課題，任課教師也可給出部分開放式研究題目供學生選擇。此外，在分子生物學教學實驗時間上也實行開放式，即學生可以在規(guī)定周次內(nèi)的具體時間來實驗室進行試驗項目研究。通過開放式的實驗教學模式，提高了學生自己動手做實驗的興趣，同時，方便了學生實驗時間的安排。
2.3 科研轉(zhuǎn)化分子生物學實驗教學
通過近年來分子生物學實驗教學的實踐，將教師的科研課題轉(zhuǎn)化為實驗教學內(nèi)容是一種很好的實驗教學改革模式。首先，由于生命科學領(lǐng)域進展很快，甚至超越了電子信息技術(shù)，所以在一般的教師科研項目中，會有大量全新的內(nèi)容補充到實驗教學內(nèi)容中，從而使實驗教學內(nèi)容能夠不斷更新；其次，教師的科研課題一般代表了該領(lǐng)域全新的研究內(nèi)容和研究方法，這就使我們的分子生物學實驗教學內(nèi)容能夠緊跟該領(lǐng)域的研究步伐，不至于過于陳舊、落后。同時，使得當代個性化發(fā)展的90后學生能在分子生物學實驗教學過程中了解并掌握生產(chǎn)實踐中的實用技術(shù)，為日后實踐工作或繼續(xù)深造奠定了扎實的基礎(chǔ)。
3 結(jié)語
本文通過實踐調(diào)研、教學經(jīng)驗、綜合各工科高校優(yōu)勢培養(yǎng)理念后認為：新形勢下分子生物學實踐教育應以90后高校大學生為主體、生命科學學院專職、專業(yè)實驗教師為主導力量。另外，輔以專業(yè)基礎(chǔ)實驗室、探究性學習實驗室、本科生開放性實驗、各類高端互動實驗、創(chuàng)新性課題實驗、生產(chǎn)實習與調(diào)研的全方位、立體化、多層次、高效率的分子生物學實驗教育教學模式，有利于培養(yǎng)90后大學生分子生物學綜合實驗技能、創(chuàng)新能力、嚴謹精神、邏輯思維和科研素養(yǎng)以及90后生物專業(yè)學生分子生物學實驗個性化實踐教育的全面培養(yǎng)。
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關(guān)鍵詞：研究型教學；生物化學與分子生物學；大學生科技創(chuàng)新
中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）18-0146-02
進入21世紀后，分子生物學的發(fā)展迅猛，新技術(shù)新手段層出不窮并已滲透到各個學科；分子生物學理論與技術(shù)已經(jīng)成為人們認識生命本質(zhì)和改造生物特性的有力武器。然而，我們在指導大學生科技創(chuàng)新活動中發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)學生（即使考試成績很好的學生）很難能應用所學的分子生物學理論與技術(shù)設計出科學研究的實驗方案；我們調(diào)查也發(fā)現(xiàn)：很多碩士研究生在利用分子生物學理論與技術(shù)設計科學研究實驗方案時仍困難重重，這說明我們傳統(tǒng)的“老師講、學生聽、再考試”按部就班的生物化學與分子生物學教學模式已經(jīng)很難實現(xiàn)“培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新性人才”的目標。那么，如何在教學中引導學生進行科技創(chuàng)新？
隨著近年來分子生物學的飛速發(fā)展，給生物化學與分子生物學教學帶來一些問題，主要體現(xiàn)為：教學學時的不足與教學內(nèi)容的擴增；學生理論知識的學習與科學研究實驗環(huán)節(jié)的嚴重脫離，這是造成分子生物學知識在應用中“困難重重”的主要原因。
研究型教學也稱主題研究，是在美國布魯納的“發(fā)現(xiàn)式學習模式”和瑞士皮杰的“認知發(fā)展學說”基礎(chǔ)上構(gòu)建的教學模式[1]，是在老師指導下有目的地相對獨立地對教學內(nèi)容相關(guān)的實際問題進行探索研究，從而提高學生運用知識解決實際問題的能力，從而培養(yǎng)出具有獨立思考研究能力的創(chuàng)新型及應用型人才。
“開展大學生創(chuàng)新教育、培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新性人才”是高等教育改革與持續(xù)發(fā)展的一個重要主題。為堅持“教學以學生為本”的原則，以培養(yǎng)“實踐能力強、綜合素質(zhì)高”的創(chuàng)新型醫(yī)學人才為中心，我們以“腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室”為平臺，以教師承擔的科研項目為引導，在生物化學與分子生物學理論及實驗教學中探索并實踐“研究型教學”模式。
1.優(yōu)化和整合理論教學內(nèi)容，夯實學生創(chuàng)新基礎(chǔ)。生物化學與分子生物學發(fā)展快速，新技術(shù)、新方法、新成果不斷涌現(xiàn)。我們根據(jù)教學大綱要求，優(yōu)化、整合教學內(nèi)容：刪除淘汰的內(nèi)容，合并重復的內(nèi)容，增加新出現(xiàn)的內(nèi)容。在課堂講授中，將國內(nèi)外一些最新分子生物學研究成果、發(fā)展動態(tài)及科學前沿知識充實到教學內(nèi)容中；介紹分子生物學新技術(shù)在疾病診斷、治療、預防中的最新進展，使學生明白生物化學與分子生物學在醫(yī)學中的重要性。
2.利用多種現(xiàn)代化教學方法和手段，激發(fā)學生科技創(chuàng)新興趣。生物化學與分子生物學課堂內(nèi)容豐富、信息量大，而教學課時少。因此，我們在理論教學中將教學內(nèi)容分為講授和自學兩部分：在講授中，利用多媒體等多種現(xiàn)代化教學手段，將難點和抽象的內(nèi)容以動畫的形式反應出來，使教學內(nèi)容直觀化，增加學生對知識的掌握；在自學中，充分利用網(wǎng)絡教學平臺實現(xiàn)師生之間、生生之間的交流互動；同時將教師承擔的科研課題設置成科研專題，讓學生帶著科研專題的問題開展學習。
3.加強實踐教學，培養(yǎng)學生科技創(chuàng)新能力。我們在重視理論知識教學的基礎(chǔ)上，加強實踐教學與理論教學相結(jié)合。我們重新組合實驗內(nèi)容，實行“三型實驗原則”（即將實驗分為驗證型實驗、綜合型實驗、研究型實驗）：減少基礎(chǔ)性驗證型實驗、增加設計性綜合型實驗、開展創(chuàng)新性研究型實驗。
在課堂內(nèi)的基礎(chǔ)性實驗部分：減少傳統(tǒng)的驗證性及臨床生化指標測定的實驗項目及學時數(shù)，使實驗項目主要集中于基本操作、比色技術(shù)、離心技術(shù)、層析技術(shù)及電泳技術(shù)等方面的實驗；對基本的規(guī)范化實驗操作方法及常規(guī)實驗技術(shù)（如比色、離心、層析、電泳等技術(shù)）操作流程錄像后上傳到課程網(wǎng)站中以便學生對照學習。
在課堂內(nèi)的設計性綜合型實驗部分：我們組織學生針對教學中遇到的問題設計研究方案。例如，在肝臟生物化學中提到：白蛋白主要是由肝臟合成，而白蛋白又是臨床醫(yī)療和科研中常用制劑，如何提取出有活性的白蛋白？如何利用生物技術(shù)大量生產(chǎn)白蛋白？通過討論，使學生了解解決這一問題所依據(jù)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和分離純化、基因表達、基因重組、PCR等理論知識。通過設計白蛋白分離純化與鑒定實驗，在對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)加深理解的同時，使學生掌握合理運用鹽析沉淀、離子交換層析等技術(shù)操作流程；在此基礎(chǔ)上，啟發(fā)學生運用基因重組、RT-PCR等分子生物學技術(shù)設計重組表達白蛋白的實驗方案。指導教師對學生設計的研究方案可行性和合理性進行點評及修改，學生在老師指導下，在課堂內(nèi)開展上述設計性綜合型實驗。
4.在課堂外的創(chuàng)新性研究型實驗部分：學生組成多個研究小組（3～5人/組）對教師承擔的科研課題（已設置成多個科研專題）查閱文獻和資料后進行創(chuàng)新性科研專題申請書的撰寫；指導老師根據(jù)申請書質(zhì)量及個人興趣愛好挑選部分研究小組開展科研專題的實驗研究；在此過程中，學生利用課余時間在老師指導下開展創(chuàng)新性實驗研究，從而進一步培養(yǎng)科技創(chuàng)新能力。
5.研究型教學模式在生物化學與分子生物學教學中的效果：通過研究型教學模式在三峽大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)的生物化學與分子生物學教學中的探索與實踐，我們發(fā)現(xiàn)學生的考試成績顯著高于未經(jīng)過研究型教學模式的班級；學生的動手操作能力也顯著高于未經(jīng)過研究型教學模式訓練的學生。通過研究型教學模式，學生的科研素質(zhì)和創(chuàng)新能力得到提高，激發(fā)了學生對生物化學與分子生物學的學習興趣，極大調(diào)動了學生的學習積極性。通過學生課外完成的科研專題研究，學生以第一作者在CSCD核心期刊發(fā)表研究論文7篇；指導老師在指導大學生科研專題的同時，圓滿完成了自己所承擔的科研課題的研究；同時老師通過完成科研課題，促進自己的教學水平。
總之，通過上述一系列的探索與實踐，能充分調(diào)動學生學習積極性，開闊視野，增加學生對生物化學與分子生物學及科技創(chuàng)新活動的興趣；更重要的是能提高學生的實踐動手能力，培養(yǎng)學生的科技創(chuàng)新能力；同時，老師通過完成科研課題，帶動人才培養(yǎng)；能使教師把教學與科研有機結(jié)合起來，以科研促進教學；使教師不斷更新教學內(nèi)容，不斷改善教學框架，形成囊括最新知識框架的教學體系，從而使《生物化學與分子生物學》教學質(zhì)量得以進一步提高；即充分證明研究型教學模式在生物化學與分子生物學教學實踐中是有效和可行的。
摘要：簡要介紹生物工程專業(yè)分子生物學學科特點及學生學習中遇到的困惑，對分子生物學教學改革進行了探討，并取得了較好的教學效果。
關(guān)鍵詞：分子生物學；生物工程；教學改革
生物工程專業(yè)是以生物學基本原理為理論基礎(chǔ),以工程學的方法研究并解決生物技術(shù)和生命科學中的技術(shù)問題。從人才培養(yǎng)的行業(yè)要求看,作為生物工程專業(yè)的應用型人才,在知識的儲備方面,應具有一定的專業(yè)基礎(chǔ)知識、寬廣的人文社會知識、較強的實踐管理知識以及相關(guān)的其它知識；在實際能力培養(yǎng)方面,應該具備較強的社會生存適應能力、知識更新能力、工程管理實踐能力、創(chuàng)新能力；在素質(zhì)要求方面,應具有良好的思想道德素質(zhì)、科學文化素質(zhì)和身體素質(zhì)[1]。分子生物學是前沿性很強的一門基礎(chǔ)課,目前,分子生物學已經(jīng)深入到生物學科的各個領(lǐng)域,我們應當適應學科發(fā)展的實際情況,開拓思路,與時俱進,使分子生物學課程教學為實現(xiàn)培養(yǎng)應用型生物工程專業(yè)人才目標服務。
一、分子生物學課程教學改革的必要性
（一）分子生物學課程的重要性。
分子生物學是生物工程專業(yè)的專業(yè)基礎(chǔ)課，是現(xiàn)代生物學綜合發(fā)展的最高水平?，F(xiàn)代分子生物學以躍入學科高速發(fā)展期，以滲透到生物的各個學科并作為深入研究的工具和平臺。由于分子生物學是在分子水平上對生物進行探究和改造，其研究成果能夠從生物的本質(zhì)上認識和利用生物，因此，分子生物學對生物工程本科是非常重要的課程。
（二）分子生物學在生物工程專業(yè)本科學生未來發(fā)展中的作用。
分子生物學對進一步深造的學生奠定了專業(yè)基礎(chǔ)，對生物工程本科就業(yè)的學生來說也有重要的作用。就業(yè)在與分子生物學間接有關(guān)崗位上的學生，可能在其某些環(huán)節(jié)上與該學科有關(guān)；對在分子生物學直接有關(guān)崗位上就業(yè)的學生，作用當然會更大,其就業(yè)情況詳見調(diào)查表。
（三）分子生物學課程教學改革的必要性。
分子生物學內(nèi)容繁雜、發(fā)展迅猛。針對學生在該課程學習中反映的理解困難,為了幫助學生掌握分子生物學基礎(chǔ)理論知識和提高實驗技能，激發(fā)學生學習的主動性和積極性,亟需對目前的分子生物學課程教學進行改革。
二、教學改革的實施方法與效果
（一）選擇好教材, 重視知識更新。
教材是學生獲取知識的首要途徑。對于首次接觸分子生物學的學生來說，選擇一本合適的教材，既可以使學生克服畏難情緒，也有助于學生理解抽象概念與規(guī)律，建立起對該門課程的興趣和信心，順利地邁進分子生物學的大門。首先，我校生物工程專業(yè)分子生物學課程安排在第三學年第一學期，學生雖然已經(jīng)學過了生物化學和遺傳學，分子生物學的大部分概念、內(nèi)容對學生而言仍是晦澀難懂，導致學生產(chǎn)生畏難情緒。其次，由于分子生物學發(fā)展日新月異, 新知識新技術(shù)不斷涌現(xiàn), 新版教材不斷推出，給教材的選擇帶來了一定的困難。只要我們能夠把握該課程的基本脈絡并對更新的知識作適當?shù)难a充，就能又快又好地掌握該門課程。我們積極收集最新的教材和資料,不斷更新教學內(nèi)容。通過比對各種教材內(nèi)容、體系設計和風格特點, 我們選用了朱玉賢等主編的《現(xiàn)代分子生物學》，該教材綜合了生命科學在分子水平上所取得的研究成果、基本規(guī)律、原理與技術(shù)，全面完整地反映了分子生物學各領(lǐng)域的最新進展[2]，符合生物工程本科教學的要求。
（二）制定科學合理的教學方案。
目前分子生物學理論課中,有三個比較突出的問題：一是課時少內(nèi)容多；二是內(nèi)容較抽象；三是教學內(nèi)容與很多學科相互聯(lián)系、相互滲透。為了使本學科與其它課程的知識緊密銜接而又避免重復, 合理取舍教學內(nèi)容, 制定切實可行的教學方案, 教學內(nèi)容選擇時把握三個原則：第一，側(cè)重學科的基本理論和基本技能；第二，注意一些趣味性的動畫和模具等的使用；第三，注意和相關(guān)科目教師的教學交流，淡化與其它學科重復的內(nèi)容。對于學過的知識只做簡單的復習, 而在此基礎(chǔ)上將知識向縱深、向高層次擴展。
（三）把握學科特點, 激發(fā)學生學習興趣。
實踐證明, 培養(yǎng)學生學習興趣是開發(fā)學生創(chuàng)造性思維能力、提高教學效率的必要措施之一。在教學中合理地穿插具有趣味性、新穎性、啟發(fā)性和熱點問題的知識。例如在學習逆轉(zhuǎn)錄時，我們可以穿插講解AIDS病毒的復制轉(zhuǎn)錄機制，這樣通過理論和實踐結(jié)合，不僅可以加深學生對該知識點的理解和記憶，而且學生聽后興趣盎然，視野開拓，將有利于激發(fā)學生的求知欲和培養(yǎng)學生的創(chuàng)造力。
（四）改進教學方法與手段。
分子生物學是一個抽象繁雜的知識體系，傳統(tǒng)的“填鴨式”教學方法很難使學生深入理解和掌握，因此迫切需要改進教學方法和豐富教學手段。
1.采用現(xiàn)代化多媒體手段。多媒體教學利用動畫展示事物發(fā)展的動態(tài)或推理的全過程，將抽象的理論的東西形象化具體化，能給學生創(chuàng)造更生動的實際情境，更多樣地體驗理論的實用性，并充分激發(fā)學生的學習興趣和潛能，能夠有效的克服傳統(tǒng)教學方式的缺陷。對于分子生物學這類信息量大圖文并茂的課程來說，采用多媒體教學特別適合，可使學生產(chǎn)生新鮮感，激起學習熱情，提高教學效果。
2.強化教學互動。在教學中，要加強教與學的互動，使學生融入到課堂教學中，最大限度地調(diào)動學生的學習積極性。老師詳細說明各章節(jié)的重點和難點，鼓勵學生結(jié)合教材主動進行學習，帶著問題進入課堂，同時在講課時，有意識地穿插一些具有趣味性和啟發(fā)性的熱點問題，引導學生積極思考，激發(fā)學生探索知識的興趣，將抽象的分子生物學知識理解透徹，有利于培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維能力。
3.培養(yǎng)科研創(chuàng)新能力。根據(jù)教師自身的研究項目充實課堂教學內(nèi)容，把相關(guān)的知識融入到教學中，從項目的立題依據(jù)、研究方法、科研成果等方面進行闡述，使學生領(lǐng)悟分子生物學的研究思路和意義，開拓學生的思維，激發(fā)求知欲，逐步培養(yǎng)學生的科研興趣，提高學生的基本科研素質(zhì)。
（五）重視分子生物學實驗,培養(yǎng)學生的實踐操作能力
分子生物學是一門以實驗為基礎(chǔ)的課程。因此，在分子生物學教學中開設實驗課是十分必要的。分子生物學技術(shù)內(nèi)容豐富，學生通過動手操作，不僅可以增加對所學理論知識的感性認識，而且可以把所學理論運用到實踐中解決實際問題。因此，開設分子生物學實驗是加深學生對理論知識的理解，培養(yǎng)學生獨立思考和獨立工作能力以及創(chuàng)造能力的良好途徑。
實驗課作為理論知識的“現(xiàn)實版”,也是培養(yǎng)學生動手能力和科研能力的實踐課。在實驗課教學工作中,應加強所選實驗內(nèi)容的針對性、完整性和先進性。在實驗過程中,應注意對學生分析解決問題能力、實驗設計能力以及思維能力的培養(yǎng)和鍛煉[3]。
（六）利用網(wǎng)絡資源,提高學生獲取知識的能力
互聯(lián)網(wǎng)上的信息資料和研究成果可以共享,掌握互聯(lián)網(wǎng)資源的查詢和利用是了解學科發(fā)展動態(tài)和獲得已有研究成果的有效途徑。
三、總結(jié)與展望
通過我們的教學改革，生物工程專業(yè)分子生物學教學效果得到明顯改善，學生的出勤率增加，課堂氣氛活躍，自主學習能力、思考能力和分析解決問題能力均明顯提高。為了進一步提高生物工程專業(yè)大學生的實踐和創(chuàng)新能力，尚需在以下三個方面加強改革：第一，鼓勵學生參加教師的科研項目，使教學和科研相互促進，在科研中提高綜合素質(zhì)；第二，進一步提高任課教師的教學水平，大力發(fā)展計算機輔助教學，以更加靈活多樣的方式完成教學；第三，結(jié)合分子生物學學科特點和學生學習時的困惑，應寓教于樂，夯實基礎(chǔ)，開拓視野，培養(yǎng)喜歡學科、熱愛專業(yè)、認真學習和綜合素質(zhì)高的生物工程專業(yè)本科應用型人才。
參考文獻：
[1]劉迎春,熊志卿.應用型人才培養(yǎng)目標定位及其知識、能力、素質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究[J].中國大學教學,2004(10):56-57.
[2朱玉賢，李毅，鄭曉峰等.現(xiàn)代分子生物學第三版［M］北京: 高等教育出版社，2007
