發(fā)布時(shí)間：2023-05-31 15:00:08
序言：寫作是分享個(gè)人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
述。
1胞外生物支架材料的應(yīng)用
研究者對(duì)各種胞外支架材料進(jìn)行了研究，包括聚乙烯樹脂、海藻酸鹽、聚氨酯泡沫等，都是具有親水多孔性結(jié)構(gòu)的天然或人工合成的有機(jī)大分子。在一定的培養(yǎng)條件下，肝細(xì)胞在基質(zhì)孔隙中重組形成許多有功能的聚集體，這些聚集體中可能具有接近的細(xì)胞-細(xì)胞接觸，且形成類似于體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，因而表現(xiàn)出比早先單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞更好的生理功能。
1.1海藻酸鹽(alginate)海藻酸鹽是目前常用的促進(jìn)肝細(xì)胞聚集的物質(zhì)，藻酸鹽海綿體具有高度多孔的結(jié)構(gòu)，孔徑在100～150 μm，由于藻酸鹽是親水性物質(zhì)，所以肝細(xì)胞能容易地進(jìn)入基質(zhì)內(nèi)部。Glicklis［1］等以藻酸鹽海綿體為支持基質(zhì)培養(yǎng)肝細(xì)胞。DNA測定表明最初兩周肝細(xì)胞的數(shù)量并不增加，MTT測定顯示絕大多數(shù)細(xì)胞保持活力。接種24 h內(nèi)在藻酸鹽海綿狀結(jié)構(gòu)內(nèi)觀察到活細(xì)胞聚集體，這種聚集體在培養(yǎng)的第四天平均直徑100 μm，與基質(zhì)孔徑同一數(shù)量級(jí)。聚集體的三維結(jié)構(gòu)促進(jìn)了細(xì)胞功能的表達(dá)：1周內(nèi)達(dá)最大白蛋白分泌量。微囊化肝細(xì)胞培養(yǎng)利用半透膜將肝細(xì)胞包在囊內(nèi)(囊壁分子量截率
1.2聚氨酯泡沫(Polyurethane foam，PUF)聚氨酯泡沫是另一種高度多孔性的過濾材料。日本Gion等［3］以PUF為材料設(shè)計(jì)出一種填充床式生物反應(yīng)器，以該反應(yīng)器為基礎(chǔ)組成的混合型生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL），在狗肝衰竭模型中，可顯著降低血氨和血清肌酐，升高血糖和血壓。Pahernik等［4］研究了以PUF材料進(jìn)行豬肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)的可行性，作者認(rèn)為PUF是一種生物相容性較好的材料，適于肝細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。Kurosawa等［5］采用聚氨酯膜(Polyurethane membrane，PΜM)作為肝細(xì)胞培養(yǎng)支持物，構(gòu)建固定床(fixedbed)生物反應(yīng)器并用于大鼠肝細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。PΜM孔徑從上層到下層逐漸遞減，肝細(xì)胞懸液流經(jīng)PΜM時(shí)，5 min內(nèi)黏附的肝細(xì)胞密度可達(dá)2～3×107/cm3PΜM，黏附效率高達(dá)99%；黏附肝細(xì)胞以輕度聚集的球形體形式存在，白蛋白分泌持續(xù)時(shí)間比單層培養(yǎng)長。
1.3微載體(microcarrier)微載體目前經(jīng)常用于生物型人工肝的肝細(xì)胞培養(yǎng)，可以大大提高生物反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的培養(yǎng)密度。微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以形成以微載體為核心的肝細(xì)胞聚合球，細(xì)胞濃度可達(dá)107 cell/ml，使肝細(xì)胞不貼壁而呈懸浮狀培養(yǎng)，更接近于正常的生理狀態(tài)。Wermer等［6］用不同密度的永生化人肝細(xì)胞與不同濃度的明膠微載體進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)7 d后，2×105 cell/ml與1 g/L微載體組獲得的細(xì)胞濃度為4.5×106 cell /ml；5×105 cell/ml與3 g/L微載體組細(xì)胞濃度為7.1×106 cell/ml。微載體上沾滿細(xì)胞，呈球形狀態(tài)。肝細(xì)胞24 h可產(chǎn)生5 ng/ml乙基甘油二甲基苯胺(EMGX)，而用50 ng/ml苯巴比妥誘導(dǎo)3 d后，則產(chǎn)生26 ng/ml的MEGX，顯示了肝細(xì)胞代謝的潛能。目前，微載體培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模高密度培養(yǎng)中技術(shù)相對(duì)完善及有實(shí)用價(jià)值的一種培養(yǎng)模式，并且已有多種商品化的微載體可供選擇。
1.4中空纖維(hollow fiber)中空纖維是人工合成的高分子材料半透膜，纖維內(nèi)腔直徑約200 μm。將數(shù)百或數(shù)千束纖維裝在容器中，即中空纖維艙，最常用于構(gòu)建生物型人工肝生物反應(yīng)器。Liu等［7］對(duì)體外中空纖維肝輔助裝置中的永生化豬肝細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種后增殖迅速，在培養(yǎng)的25 d期間，肝細(xì)胞保持著對(duì)安定及撲熱息痛的代謝活性。超微結(jié)構(gòu)檢查可見形成膽小管結(jié)構(gòu)的橋粒及連接復(fù)合體。Sosef［8］等將豬的自體肝細(xì)胞置于中空纖維倉，培養(yǎng)24 h后治療豬急性肝功能衰竭（FHF）模型，明顯延長存活時(shí)間，降低血氨水平。在多種材料結(jié)合的基礎(chǔ)上，研究者提出并嘗試了多種有應(yīng)用價(jià)值的肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。Arnaout［9］等在中空纖維外腔植入微載體培養(yǎng)的肝細(xì)胞構(gòu)建生物型人工肝，對(duì)FHF和慢性先天性代謝性肝病動(dòng)物模型均有肝輔助作用。Nyberg［10］等在中空纖維內(nèi)腔內(nèi)種植膠原凝膠包埋肝細(xì)胞，培養(yǎng)液在膠原外纖維內(nèi)循環(huán)，形成肝細(xì)胞培養(yǎng)的三維框架，患者血漿在纖維外灌流，體外實(shí)驗(yàn)證明此系統(tǒng)具有合成蛋白功能及藥物代謝功能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)芨纳艶HF動(dòng)物模型肝功能指標(biāo)，但未見進(jìn)一步的臨床應(yīng)用報(bào)道。Dixit［11］將兩種不同的中空纖維管置于同一外殼內(nèi)，其中一種通過培養(yǎng)液，纖維外部附肝細(xì)胞; 另一纖維管循環(huán)宿主血液/血漿。體外實(shí)驗(yàn)研究表明這種肝細(xì)胞反應(yīng)器可提供特異性的肝細(xì)胞功能。Gerlach［12］等將細(xì)胞培養(yǎng)于三維網(wǎng)狀交叉的中空纖維之間，實(shí)驗(yàn)表明可使肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)，肝細(xì)胞功能維持可達(dá)5周。Funatu K［13］等用聚氨酯泡沫(polgurethanefoam，PUF)在離心條件下中空纖維內(nèi)培養(yǎng)肝細(xì)胞，3 d內(nèi)形成表面光滑的柱型組織化結(jié)構(gòu)(Organoid)，維持肝功能達(dá)4個(gè)月以上，Nakazawa［14］應(yīng)用此種生物反應(yīng)器治療FHF豬動(dòng)物模型可改善其生化指標(biāo)，提高生存率。
1.5其他Tobe S［15］等報(bào)道大鼠的肝細(xì)胞能夠附著著在一種缺乏唾液酸蛋白的聚DP芐乙烯D乳酰氨(polyNpvinylbenzylDlactonamide，PVLA)上形成錨定的多層聚集體，在培養(yǎng)液中加入EGF和胰島素時(shí)形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。這種聚集體中的肝細(xì)胞有很高的白蛋白分泌能力，作者推測可能是多層聚集體中的細(xì)胞通過聚集體的形成而穩(wěn)定地分化所致。Ohshima等［16］將聚乙烯樹脂(Polyvinyl formal，PVF)置于一圓柱形容器內(nèi)組成一種填充床式生物反應(yīng)裝置，適于肝細(xì)胞的培養(yǎng)密度可達(dá)107 cell/cm3，且培養(yǎng)肝細(xì)胞具有良好的氨代謝、尿素合成及分泌白蛋白等功能；掃描電鏡觀察顯示，肝細(xì)胞在形態(tài)及排列等方面均優(yōu)于單層培養(yǎng)。
2模擬微重力培養(yǎng)
模擬微重力肝細(xì)胞培養(yǎng)是利用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，提供一個(gè)模擬微重力的條件，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞呈一種失重狀態(tài)，可自發(fā)形成組織樣結(jié)構(gòu)。研究者們?cè)谝幌盗械募?xì)胞三維培養(yǎng)研究中先后取得重要進(jìn)展表明，利用回轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境，可以顯著改善離體細(xì)胞的生長狀況，使在普通培養(yǎng)條件下只能二維貼壁生長的動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)出三維增殖與分化。Rise k等［17］等利用模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境共培養(yǎng)純化的肝細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞自發(fā)聚集于聚合物支架上，生長達(dá)2個(gè)月，在三維結(jié)構(gòu)上肝組織內(nèi)有肝索、膽管以及管狀內(nèi)皮結(jié)構(gòu)形成。國內(nèi)張鈺鵬［17］也在模擬微重力條件下進(jìn)行大鼠原代肝細(xì)胞微載體培養(yǎng)，多個(gè)微載體表面的肝細(xì)胞可連接成團(tuán)，形成“肝細(xì)胞微載體聚球體”的基本結(jié)構(gòu)模式。透射電鏡下，肝細(xì)胞在不同部位顯現(xiàn)不同的膜結(jié)構(gòu)：與培養(yǎng)液接觸的表面出現(xiàn)許多不規(guī)整的微絨毛，類似體內(nèi)的肝竇面。肝細(xì)胞之間則胞膜平直，膜間縫隙狹窄，類似體內(nèi)的肝細(xì)胞間接觸面。
3展望
【關(guān)鍵詞】三維細(xì)胞培養(yǎng)；流感病毒；監(jiān)測
【中圖分類號(hào)】R372 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004―7484（2013）09―0118―01
2009年5月，新甲型H1N1病毒造成世界范圍內(nèi)的大流行，2013年春季在中國長三角地區(qū)流行甲型H7N9流感病毒，加強(qiáng)對(duì)流感病毒監(jiān)測對(duì)于疫情分析、流行趨勢(shì)研判、疫苗研制等方面有著極其重要的意義。目前國內(nèi)在流感病毒監(jiān)測方面主要采用核酸檢測和單層貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。由于標(biāo)本采集的問題及細(xì)胞在體外環(huán)境下生長逐漸喪失了原有的性狀[1]，在很多情況下，所取到的研究結(jié)果和實(shí)際結(jié)果不符合。傳統(tǒng)單層細(xì)胞培養(yǎng)得率過低是大量病毒監(jiān)測工作中難以突破的的瓶頸。我們建立了三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法在流感病毒的網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測中得到較好的應(yīng)用。
1 材料與方法
1.1 樣本采集：上海市黃浦區(qū)流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測定點(diǎn)醫(yī)院（第二人民醫(yī)院）流感監(jiān)測點(diǎn)于2013年1-2月冬春季采集的類流感病例鼻咽拭子合計(jì)76份。
1.2 核酸抽提：取鼻咽拭子病毒采樣液140微升，使用QIACUBE?核酸抽提儀，試劑使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit（250）試劑盒提取病毒RNA。
1.3 流感病毒核酸檢測：Real-Time RT- PCR檢測使用上海之江生物技術(shù)有限公司甲型流感病毒核酸檢測試劑盒（A型/B型流感核酸檢測試劑盒、H1、H3、H1N1（2009pdm）型核酸檢測試劑盒），PCR擴(kuò)增儀使用國產(chǎn)上海宏石SLAN熒光定量PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件如下：45 ℃ 10 min逆轉(zhuǎn)錄，95 ℃ 15 min變性，95 ℃ 15s，60℃ 1min FAM通道檢測熒光，40個(gè)循環(huán)。
1.4三維細(xì)胞培養(yǎng)
1.4.1培養(yǎng)儀：采用Hamilton?公司的BioLevitator?三維細(xì)胞培養(yǎng)儀。
1.4.2細(xì)胞來源：75mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶復(fù)蘇的狗腎細(xì)胞（MDCK），消化后得到懸浮細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞接種到GEM微載體上，在培養(yǎng)設(shè)備上運(yùn)行接種程序。當(dāng)細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，加入兩倍量的新的GEM微載體。繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中根據(jù)需要更換新的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，將培養(yǎng)管內(nèi)溶液分裝到三個(gè)新的培養(yǎng)管中。向三管中分別加入兩倍于原體積的新培養(yǎng)基和兩倍于原數(shù)量的GEM微載體。在培養(yǎng)設(shè)備上運(yùn)行接種程序。
1.4.3細(xì)胞生長：當(dāng)細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，取出培養(yǎng)管，用磁鐵吸住GEM微載體，移去培養(yǎng)基。用3-Dissolution試劑將GEM微載體溶解，用磁鐵吸去磁性顆粒，得到細(xì)胞。轉(zhuǎn)移細(xì)胞溶液至新的50mL管中，將細(xì)胞清洗、懸浮后細(xì)胞分裝并計(jì)數(shù)。細(xì)胞樣品可以用于下游的檢測或其它應(yīng)用。
1.4.4接種病毒
1.4.4.1接種中毒：當(dāng)細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)到要求后，開始進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。采用上述9份季節(jié)性流感病毒H3核酸檢測陽性標(biāo)本分A、B組進(jìn)行染毒試驗(yàn)。A組為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞，B組為三維細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞。置37?C， 7.5% CO2濃度培養(yǎng)，每天觀察，當(dāng)有90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，進(jìn)行收毒。
1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入離心管，在1，000-2，000轉(zhuǎn)下離心10mins，以此除去細(xì)胞碎片，將離心后的上清夜轉(zhuǎn)移，棄底部沉淀，該上清液進(jìn)行病毒滴度測定。
1.4.5 三維細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的觀察與計(jì)數(shù)
1.4.5.1取50μL培養(yǎng)液（cells on GEM?）至96孔板中的一個(gè)孔內(nèi)。加入100μL Hoechst 33342溶液到該孔內(nèi)。室溫下放置15-20分鐘。用顯微鏡在紫外和DAPI濾光片下觀察。
1.4.5.2細(xì)胞計(jì)數(shù)用CubeMagnet將剩余的400μL細(xì)胞樣品中的生長在GEM上的細(xì)胞吸附到底部。用移液器將培養(yǎng)基移除。加入1mL PBS到樣品中。在CubeMagnet幫助下，移除PBS緩沖液。加入200μL 3-Dissolution到樣品中。37?C孵育10-15分鐘，用顯微鏡觀察直到GEM被完全溶解。將蓋玻片平鋪在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。加入50μL Trypan Blue和50μL細(xì)胞樣品到微離心管中。蓋上蓋子混勻。取10μL細(xì)胞/Trypan Blue混合物到蓋玻片下面。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)活/死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
1.5 MDCK單層細(xì)胞培養(yǎng)：參照中國國家流感中心實(shí)驗(yàn)室流感病毒監(jiān)測方案操作方法。[2]
1.6 血凝試驗(yàn)方法：參照中國國家流感中心實(shí)驗(yàn)室流感病毒監(jiān)測方案操作方法。[2]
1.7 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)與分析使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件stata 7.0。
2 結(jié)果
2.1 標(biāo)本直接核酸檢測結(jié)果：經(jīng)RT-PCR篩查甲型流感核酸陽性標(biāo)本9份，陽性率為11.8%（9/76）。其中H3分型陽性6例，未分型（包含H1、H3、H1N1（2009pdm））共3例。CT值分別為29.2，31.2，32.1，33.2，35.2，37.5 。
2.2細(xì)胞生長效率比較：75mL細(xì)胞瓶狗腎細(xì)胞（MDCK）工作容量為10mL，細(xì)胞總數(shù)為2*106個(gè)。傳統(tǒng)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)傳代一次可以得到9瓶25mL細(xì)胞瓶的狗腎細(xì)胞用于病毒培養(yǎng)，其工作容量約為18毫升單位細(xì)胞數(shù)2.5*105個(gè)/mL，得到的細(xì)胞總數(shù)約為4.5*106個(gè)。利用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)后可以得到4瓶40mL細(xì)胞懸液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板5次，結(jié)果見表一。 計(jì)算公式：總細(xì)胞數(shù)=單格細(xì)胞計(jì)數(shù)*104*160/ml。
2.3 接種中毒后血凝效價(jià)比較：用9份甲型流感病毒病毒核酸陽性標(biāo)本，采樣液染毒后血凝效價(jià)測定結(jié)果見表二，A組為單層細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中毒，B組為三維細(xì)胞培養(yǎng)后中毒實(shí)驗(yàn)。
以上結(jié)果用幾何均數(shù)配對(duì)T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果P > |t| = 0.5943，顯示三維培養(yǎng)傳代細(xì)胞的染毒實(shí)驗(yàn)滴度與貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞中毒后血凝試驗(yàn)效價(jià)結(jié)果無顯著性差異。
2.4 甲型流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)后核酸檢測結(jié)果比較：將9例經(jīng)直接檢測甲型流感核酸陽性標(biāo)本分別接種三維培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，CO2培養(yǎng)，觀察中毒后，重新抽核酸進(jìn)行核酸分型檢測，均為H3型季節(jié)性流感。結(jié)果見表三。A組為單層細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中毒液檢測，B組為三維細(xì)胞培養(yǎng)后中毒液檢測。
以上結(jié)果用配對(duì)T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果P > |t| = 0.3956，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)和三維細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果無顯著性差異；細(xì)胞培養(yǎng)后病毒大量增殖，使得核酸分型檢測結(jié)果更明確。
3 討論
流感病毒的監(jiān)測包括核酸檢測和細(xì)胞培養(yǎng)兩方面。細(xì)胞培養(yǎng)是對(duì)流感病毒對(duì)細(xì)胞的敏感性，抗原性分析的必須方法，也可以通過細(xì)胞中毒實(shí)驗(yàn)使得某些直接核酸檢測結(jié)果不明確的標(biāo)本得以明確病毒核酸的分類，通過較少病毒載量的標(biāo)本在細(xì)胞中增殖也是對(duì)一些不明分類的流感病毒深入研究的基礎(chǔ)。
三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)上更貼近于自然狀態(tài)，細(xì)胞生物活性較高。[3]利用該技術(shù)得到細(xì)胞對(duì)已病毒培養(yǎng)更為高效。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以在病毒培養(yǎng)中得到極大的發(fā)展。對(duì)于三維結(jié)構(gòu)下細(xì)胞生物活性較高狀態(tài)的細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)可能大大提高流感病毒染毒效果。得益于三維培養(yǎng)技術(shù)的革新，使得該技術(shù)能夠培養(yǎng)在傳統(tǒng)培養(yǎng)板上難以培養(yǎng)的細(xì)胞；細(xì)胞生長狀態(tài)更加接近于體內(nèi)狀態(tài)，利于細(xì)胞的極化與功能化[4]；省去消化、離心等操作，簡化細(xì)胞培養(yǎng)流程；可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞；細(xì)胞的一致性可以得到保障；微載體透光性好，沒有自發(fā)熒光，不必與細(xì)胞分離就可以進(jìn)行后續(xù)觀測；細(xì)胞培養(yǎng)表面大，可以獲得高密度細(xì)胞；微載體材質(zhì)與結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞生長，表面提供各種蛋白包被可滿足特殊細(xì)胞培養(yǎng)的需求；微載體內(nèi)嵌磁性顆粒，便于外加磁力進(jìn)行操控；大大減少耗材用量，降低耗材成本，并且有利于環(huán)保；減少研究者在細(xì)胞培養(yǎng)上花費(fèi)的精力。
本次研究中，三維細(xì)胞培養(yǎng)方法不僅比普通單層細(xì)胞培養(yǎng)有更多的細(xì)胞收獲，而且在病毒敏感性，血凝效價(jià)實(shí)驗(yàn)等各方面與單層細(xì)胞培養(yǎng)方法無顯著性差異。
三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在流感病毒培養(yǎng)中得以較好的應(yīng)用，該技術(shù)在細(xì)胞傳代、細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞凍存等細(xì)胞技術(shù)都已經(jīng)較為成熟。特別是細(xì)胞傳代的應(yīng)用，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與新材料新方法結(jié)合的全新思路解決和突破了傳統(tǒng)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞傳代細(xì)胞得率過低的技術(shù)瓶頸，對(duì)于我們實(shí)驗(yàn)室高通量的流感病毒監(jiān)測、培養(yǎng)具有十分重要的意義。
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誘導(dǎo)多能干細(xì)胞只是干細(xì)胞的一種，但是，可以繞開使用胚胎干細(xì)胞的倫理限制，而且具有豐富的來源，因此被視為再生醫(yī)學(xué)和器官移植的重要突破。此后，研究人員就希望能用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)和生成各種器官、組織和細(xì)胞，用以治療更多疾病。現(xiàn)在，研究人員發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞確實(shí)能培養(yǎng)并生成有生理功能的多種器官、組織和細(xì)胞。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培育出肝臟
英國《自然》雜志2013年7月3日?qǐng)?bào)道，日本橫濱市立大學(xué)谷口英樹研究小組與美國西奈山醫(yī)學(xué)院研究人員合作，利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠體內(nèi)，結(jié)果這些肝芽成功生長成微型人類肝臟或稱“迷你肝臟”，并像健康器官一樣具有正常的肝功能。這是世界上首例用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)的立體肝臟。在此之前，已經(jīng)有研究小組能夠用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)出肝細(xì)胞，但是還不能培養(yǎng)出可以在人體內(nèi)發(fā)揮功能的立體結(jié)構(gòu)肝臟。
日本和美國研究人員利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)的肝臟從嚴(yán)格意義上來說還不是肝臟，但是可以看成是微小肝臟，它們的直徑只有4毫米～5毫米，卻表現(xiàn)出了肝臟的生物活性和生理功能。
研制的過程是，將人類皮膚細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并且讓其分化成表達(dá)肝臟基因的早期肝細(xì)胞。然后在培養(yǎng)基中加入從臍帶血中提取的內(nèi)皮細(xì)胞和制造骨骼、軟骨和脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的作用是指揮血管排列和生成。此后，這些細(xì)胞在培養(yǎng)基中自行成長為球狀的細(xì)胞團(tuán)，如同人類胚胎中肝臟最初的發(fā)育一樣。兩個(gè)月后，這些細(xì)胞團(tuán)快速生長成直徑為4毫米～5毫米的微小肝臟，研究人員再把這種微小肝臟移植到小鼠的皮膚下。此后，微小肝臟與小鼠的血管慢慢連接起來，最終發(fā)育成類似成體肝臟的器官。這種微小肝臟還接管了小鼠肝臟的一些正常的工作。
為了驗(yàn)證這種微小肝臟是否有生理功能，研究人員對(duì)小鼠注射了兩種藥物，以檢查肝臟是否有代謝藥物的功能。這兩種藥物是抗炎藥酮洛芬和治療高血壓的藥物異哇胍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠的血液中產(chǎn)生了通常來自人類肝臟的代謝產(chǎn)物而非小鼠肝臟的代謝產(chǎn)物。這說明移植進(jìn)小鼠體內(nèi)的微小肝臟發(fā)揮了作用。
同時(shí)，研究人員還做了一個(gè)對(duì)照研究，以檢測微小肝臟是否有解毒功能，以便幫助肝功能衰竭的小鼠存活。實(shí)驗(yàn)用了兩組小鼠，一組小鼠的每一只體內(nèi)都植入了12個(gè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)的微小肝臟，另一組小鼠作為對(duì)照組，未植入微小肝臟。研究人員對(duì)兩組小鼠都注射白喉毒素。結(jié)果，移植了微小肝臟的一組小鼠有近1/3存活超過了40天，而對(duì)照組小鼠在10天內(nèi)都死亡了。
此外，研究還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的微小肝臟能夠分泌肝臟的特異性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且產(chǎn)生人類特異性代謝物。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的微小肝臟最為重要的特點(diǎn)是，它很快就能與附近的血管融合，從而獲得受體血液系統(tǒng)的支持。這是器官移植最重要的一步，因?yàn)橛辛耸荏w血液系統(tǒng)的支持，而且不受到受體免疫系統(tǒng)的排斥，移植的器官就會(huì)持續(xù)生長，成為受體體內(nèi)的一員。因此，盡管這種能首次連接到受體血液系統(tǒng)的具有復(fù)雜生理功能的器官還比較微小，但已經(jīng)是再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要里程碑。
當(dāng)然，未來如果能進(jìn)一步表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)的微小肝臟移植進(jìn)人體后不受人的免疫系統(tǒng)排斥，那么微小肝臟就可以移植給人體，至少可以取代成人30%的正常肝臟功能。這對(duì)于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意義。當(dāng)然，如果誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)肝臟的技術(shù)進(jìn)一步成熟和有效，則有可能培養(yǎng)出像成人肝臟那么大的肝臟，器官移植將會(huì)獲得突破性進(jìn)展，因?yàn)椴∪嗽僖膊挥瞄L時(shí)間等待供體器官了。但是，要達(dá)到這一步可能還要等上較長時(shí)間。
培育簡單器官和組織更容易
由于肝臟具有較為復(fù)雜的多種生理功能，如解毒功能、代謝功能、分泌膽汁、免疫防御功能等，這就意味著用干細(xì)胞培育肝臟更具挑戰(zhàn)性和復(fù)雜性。因此，在用干細(xì)胞培育較為簡單的器官方面，應(yīng)當(dāng)更有收獲。事實(shí)也完全證明了這一點(diǎn)。
現(xiàn)在，多個(gè)國家的研究人員已經(jīng)能用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培育多種簡單的器官，如血管、肌肉、毛囊等。
美國麻省總醫(yī)院史迪爾腫瘤生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任雷克思·杰恩等人利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的血管前體細(xì)胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且這些血管維持活性長達(dá)280天。
用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培育的血管主要可以用于治療心血管病和糖尿病導(dǎo)致的血管損害。比如，糖尿病晚期常導(dǎo)致病人的大血管并發(fā)癥，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈狹窄（可導(dǎo)致冠心病甚至心肌梗塞）、供應(yīng)大腦的血管狹窄（可導(dǎo)致腦缺血甚至腦梗塞）、供應(yīng)下肢的血管狹窄（可導(dǎo)致下肢的疼痛和壞疽），這時(shí)就可以用再造血管的方法來治療晚期糖尿病人。同時(shí)，還可以用新血管為新生組織提供血液供應(yīng)。
過去的一些研究顯示，利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能生成構(gòu)建血管所需的內(nèi)皮細(xì)胞，但是，將這些細(xì)胞導(dǎo)入到小鼠身上卻無法形成持久的血管。于是，麻省總醫(yī)院的研究人員利用來自健康成人以及1型糖尿病病人的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，在小鼠大腦外表面和皮膚下生成了血管。研究小組采用了一種最初用于人類胚胎干細(xì)胞衍生內(nèi)皮細(xì)胞的方法，以此來擴(kuò)大和培養(yǎng)人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，然后讓這些細(xì)胞群生成能夠形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞。
隨后，研究人員把這些內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)前體細(xì)胞（可生成必要的結(jié)構(gòu)細(xì)胞）一起移植到小鼠大腦的表面。在兩周內(nèi)，移植細(xì)胞形成了血液灌注的血管網(wǎng)絡(luò)，它們與鄰近的天然血管一樣發(fā)揮了功能，并在小鼠體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮功能長達(dá)9個(gè)月。此外，研究人員也用同樣的方法在小鼠皮膚下移植內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)前體細(xì)胞，結(jié)果也生成了功能性的血管。但是，在皮膚下的移植需要移植更多的細(xì)胞，約為移植到大腦的5倍以上，并且生成的血管的壽命比在大腦生成的血管壽命短。
這項(xiàng)研究還表明，來自健康人的細(xì)胞和患1型糖尿病患者的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞都可以生成能長期維持功能的血管。但是，不同的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和包括來自同一患者的不同細(xì)胞系在生成血管的潛力上有差異，因此，還需要更深入地了解干細(xì)胞生成血管的更多機(jī)理，而且需要找到更好的方法來操控生成特定器官所需的特異內(nèi)皮細(xì)胞類型。
當(dāng)然，由人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的血管是否能應(yīng)用于糖尿病病人，還需要在安全性和實(shí)用性方面進(jìn)行更深入的研究，但畢竟這項(xiàng)研究已經(jīng)讓人們看到了一些希望。
另一方面，用干細(xì)胞培養(yǎng)成熟的心肌也有了新的突破。過去，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的心肌細(xì)胞并不像人體心肌細(xì)胞那樣具有生理功能，例如傳導(dǎo)生物電信號(hào)和收縮。為了解決這些問題，美國杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的尼納德·伯薩克等人采取了一種新的方法來培育心肌，即用胚胎干細(xì)胞來培養(yǎng)心肌。胚胎干細(xì)胞不同于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，可能會(huì)受到倫理制約，而且所能獲得的胚胎干細(xì)胞也有限，當(dāng)然其全能分化和生長的效果優(yōu)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
研究人員在實(shí)驗(yàn)室中把人胚胎干細(xì)胞分化得到的心肌細(xì)胞放入三維水凝膠中。此后，心肌細(xì)胞自行組裝成心肌束，形成了纖維細(xì)胞在外、內(nèi)皮細(xì)胞穿插其中的三維結(jié)構(gòu)。而且，這種組織并非是心肌細(xì)胞的堆積，而是一塊8毫米×8毫米的心肌組織，并且達(dá)到了與體內(nèi)心肌細(xì)胞類似的功能指標(biāo)。通過注入不同的藥物可以檢測心肌電傳導(dǎo)性能的變化和檢測藥物對(duì)心肌收縮能力的影響。由此證明，這種由胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的心肌組織不僅可以傳導(dǎo)生物電流，而且可以自主搏動(dòng)。
研究人員認(rèn)為，這種心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能都超過了以前的人工心肌，也是迄今為止和人體組織最接近的人造心肌薄片。雖然這是依靠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的，但是，通過仔細(xì)總結(jié)培養(yǎng)的機(jī)理，未來可以通過提取心臟病人的皮膚細(xì)胞以獲取誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，再由后者來培養(yǎng)特異的心肌組織或心臟，如此，則可以修補(bǔ)病人的壞死心肌，或者直接為病人移植用其自身的皮膚細(xì)胞培養(yǎng)的心臟。
培育血細(xì)胞
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞還能培育更多的血細(xì)胞，以用于輸血、診斷和治療疾病。
人的血液由血漿和血細(xì)胞組成。血漿相當(dāng)于結(jié)締組織的細(xì)胞間質(zhì)，為淺黃色半透明液體，其中除含有大量水分以外，還有無機(jī)鹽、纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各種營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物等。血細(xì)胞則分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板。人的血細(xì)胞總是在不斷地新陳代謝。紅細(xì)胞的平均壽命約120天，有粒白細(xì)胞和血小板的生存期限一般不超過10天。淋巴細(xì)胞的生存期長短不等，從幾個(gè)小時(shí)到幾年。一般而言，血細(xì)胞及血小板來自造血器官，紅細(xì)胞、有粒白細(xì)胞及血小板由紅骨髓產(chǎn)生，無粒白細(xì)胞則由淋巴結(jié)和脾臟產(chǎn)生。但是，由于疾病和造血功能異常會(huì)導(dǎo)致一些血液方面的疾病，如貧血。
貧血是指人體外周血液中紅細(xì)胞容量減少并低于正常范圍下限的一種疾病，但是由于紅細(xì)胞容量測定較復(fù)雜，臨床上常以血紅蛋白（Hb）濃度來代替。在中國一般把成年男性Hb
因此，貧血的根本原因是紅細(xì)胞減少，因而導(dǎo)致血紅蛋白減少，血液攜氧供氧能力下降，這就會(huì)對(duì)全身造成不同程度的影響。例如，造成神經(jīng)系統(tǒng)的損害，表現(xiàn)為頭昏、耳鳴、頭痛、失眠、多夢(mèng)、記憶力減退、注意力不集中等；貧血更影響呼吸循環(huán)系統(tǒng)，表現(xiàn)為氣急或呼吸困難，并且有心悸、心律失常和心功能不全；貧血也影響消化系統(tǒng)，因?yàn)樨氀獣r(shí)消化腺分泌減少甚至腺體萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致消化功能降低、消化不良，出現(xiàn)腹部脹滿、食欲減低、大便規(guī)律和性狀的改變等。
長期以來，治療慢性貧血的效果并不如意。研究人員也在尋找新的方法，例如輸血和單獨(dú)輸入紅細(xì)胞。但是，輸血和輸入紅細(xì)胞也可能發(fā)生排異反應(yīng)和輸血反應(yīng)，甚至染上其他傳染性疾病。如果能用病人的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，再由后者生成紅細(xì)胞，就可以把紅細(xì)胞輸入病人體內(nèi)，治療貧血。
現(xiàn)在，美國波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的喬治·墨菲與波士頓大學(xué)公共健康學(xué)院的戴維·希爾領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)采用一種新的方法，對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分化，在試管內(nèi)制造出了大量的人類紅細(xì)胞和血小板。這些紅細(xì)胞有望用于治療貧血和診斷瘧疾、鐮狀細(xì)胞貧血，而血小板則可用來檢查心血管病和治療凝血障礙。
【關(guān)鍵詞】 脂肪干細(xì)胞； 口腔上皮細(xì)胞； 組織工程； 共培養(yǎng)
中圖分類號(hào) R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2013）36-0001-03
各種原因造成的尿道狹窄、尿道缺損是一個(gè)難題，近年來，口腔黏膜被認(rèn)為是用于尿道重建的較為理想的替代物。但口腔黏膜的獲取，也會(huì)給患者帶來諸如感覺麻木、開口及活動(dòng)受限等合并癥。組織工程技術(shù)的發(fā)展為這一難題的解決帶來了新的希望[1]。組織工程口腔黏膜有望成為尿道重建領(lǐng)域一個(gè)理想的修復(fù)重建材料[2]。脂肪干細(xì)胞（adipose tissue derived stem cell，ADSC）是2001年Zuk等[3]從人脂肪組織中分離培養(yǎng)出的一種多能干細(xì)胞，它能夠經(jīng)由旁分泌方式，分泌多種生長因子，這些生長因子能夠激活上皮細(xì)胞，促進(jìn)上皮缺損的修復(fù)[4]。將ADSC引入組織工程口腔黏膜研究，將具備良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)研究體外共培養(yǎng)環(huán)境對(duì)犬口腔上皮細(xì)胞（oral keratinocytes，OK）和ADSC增殖速率、移行速率的影響。
1 材料與方法
1.1 ADSC的獲取和鑒定
取Beagle犬腹部皮下脂肪組織，經(jīng)Ⅰ型膠原酶（Worthington，美國）消化獲得ADSC，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液（Gibico，美國）培養(yǎng)，每3天換液一次，細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶（Gibico，美國）消化傳代。取P3 ADSC，行流失細(xì)胞檢測，檢測細(xì)胞表面CD34、CD44、CD45、CD90、CD105和CD106的表達(dá)。
1.2 OK的獲取和鑒定
取Beagle犬頰黏膜，經(jīng)2.0 U/ml的Dispase Ⅱ（Roche Corporation， Germany）消化、0.05%胰蛋白酶（Gibico，美國）消化后，獲得OK，以KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)，以0.05%胰蛋白酶消化傳代。取P1 OK，爬片，行免疫熒光檢測細(xì)胞AE1/AE3的表達(dá)。
1.3 細(xì)胞移行速率的檢測
將P3 ADSC和P1 OK種植到同一個(gè)刻度培養(yǎng)皿的兩端，每日定時(shí)檢測記錄細(xì)胞的移行速率，作為對(duì)照，刻度培養(yǎng)皿兩端均種植ADSC或OK，記錄細(xì)胞移行速率。
1.4 細(xì)胞增殖速率的檢測
在ADSC細(xì)胞達(dá)到50%融合時(shí)，每日收集培養(yǎng)液上清，經(jīng)過濾除菌后，與KSFM培養(yǎng)基1∶1比例混合，形成ADSC條件培養(yǎng)基（ADSC-CM），培養(yǎng)OK細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞的增殖速率。在OK細(xì)胞達(dá)到50%融合時(shí)，每日收集培養(yǎng)液上清，經(jīng)過濾除菌后，與KSFM培養(yǎng)基1∶1比例混合，形成OK條件培養(yǎng)基（OK-CM），培養(yǎng)ADSC細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞的增殖速率。同樣檢測正常培養(yǎng)條件下OK、ADSC的增殖速率。
2 結(jié)果
2.1 成功獲取ADSC和OK
經(jīng)酶消化法能夠順利獲得ADSC和OK，ADSC呈紡錘形，少數(shù)有突起，為不規(guī)則狀（圖1左），細(xì)胞相互之間以細(xì)絲拉網(wǎng)。流式細(xì)胞檢測表明CD90、CD34、CD44、CD105表達(dá)呈陽性，CD106、CD45表達(dá)呈陰性。OK細(xì)胞呈多角形，融合后的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣外觀（圖1中），細(xì)胞形態(tài)均一、穩(wěn)定。免疫熒光見細(xì)胞AE1/AE3表達(dá)陽性（圖1右）。
2.2 共培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞移行速率升高
在單一培養(yǎng)環(huán)境下，ADSC移行速率為0.8～5.5 mm/d，共培養(yǎng)環(huán)境下ADSC的移行速率增高為0.8～6.8 mm/d。單一培養(yǎng)環(huán)境下，OK移行速率為0～1.5 mm/d，共培養(yǎng)環(huán)境下OK的移行速率增高為0.2～2.5 mm/d（圖2）。
2.3 共培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞增殖速率升高
MTT檢測表明，與常規(guī)培養(yǎng)相比，ADSC-CM培養(yǎng)環(huán)境下OK細(xì)胞的增殖曲線明顯變陡。同樣，OK-CM培養(yǎng)環(huán)境下ADSC細(xì)胞的增殖曲線也呈變陡趨勢(shì)（圖3）。
3 討論
作者：胡健 王強(qiáng) 雷寧玉 任莉 張娟
【摘要】 目的 新鮮人羊膜負(fù)載構(gòu)建兔角膜上皮，為全角膜組織工程作基礎(chǔ)。方法 采用組織塊法培養(yǎng)兔角膜緣干細(xì)胞，以新鮮人羊膜為載體，形成單層細(xì)胞膜片后用于傳代；采用相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察及AE5、p63免疫熒光鑒定。結(jié)果 培養(yǎng)24 h，兔角膜緣組織塊邊緣可見有細(xì)胞長出，之后形成“沙灘樣”移形帶，培養(yǎng)至7～8 d細(xì)胞在羊膜上形成單層膜狀，細(xì)胞透明，邊緣整齊，形態(tài)呈多樣化，以卵圓形和多邊形為主；AE5抗體、p63抗體染色陽性細(xì)胞比例分別為（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63陽性細(xì)胞比例與原代比較，無顯著性差異（P﹥0.05）；3代AE5和p63陽性細(xì)胞比例與原代比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；但4代AE5陽性細(xì)胞比例又明顯升高。結(jié)論 以新鮮羊膜為載體、采用組織塊法培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞可獲得較好的角膜上皮片，在傳代細(xì)胞中，3代細(xì)胞分化程度最低、增殖能力最強(qiáng)，最適合移植。
【關(guān)鍵詞】 角膜緣干細(xì)胞；新鮮羊膜；細(xì)胞培養(yǎng)
【Abstract】 Objective To produce rabbit corneal epithelium with cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion.Methods Rabbit limbal epithelium was cultured on human fresh amnion by tissue block method. It was passage time when the primary cells formed monolayer cell patch. Keratin 3(AE5) and p63 were detected on the primary and four generation cells with immunofluorescence. Contrast phase microscope was used to observe the appearance of cells.Results Cells outgrew from the limbal tissue block within 24 hours， then ‘sandy beach’ band formed， and confluent monolayer cell patch appeared when cultivated 7～8 days. The positive percentage of AE5 and p63 was (41.72±11.35)% and (21.57±6.36)% respectively in primary cells. Positive percentages of AE5 and p63 were no of statistical difference between the second generation cells and primary cells (P﹥0.05)， while there was significant difference between the third generation and primary cells(P﹤0.05)， and AE5 positive cells increased in the fourth generation.Conclusion Corneal epithelium is produced with cultivation of rabbit limbal stem cell by method of tissue block on human fresh amnion. Among all generations， the third generation cells are most suitable to be translated， because of the lowest differential degree and the strongest proliferative ability.
【Key words】 limbal stem cells，fresh amnion，cell culture
組織工程構(gòu)建角膜上皮是組織工程化全角膜的課題之一。角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞增殖、分化和移行的來源，目前這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到公認(rèn)。種子細(xì)胞問題解決后，載體的選擇已成為研究重點(diǎn)。本課題組采用新鮮羊膜負(fù)載培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞，為角膜上皮組織工程的載體選擇提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 組織來源：兔眼取自健康純系新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2～2.5 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，在實(shí)驗(yàn)前用0.25％氯霉素滴眼液點(diǎn)眼，4次/日，共3 d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等傳染病的剖腹產(chǎn)婦的胎盤。
1.1.2 主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Hyclone公司），鼠抗兔單克隆AE5抗體（K3抗體）、鼠抗兔單克隆抗體p63（英國Abcam公司），免疫熒光染色試劑盒（Sigma公司），硝酸纖維素膜（北京鼎國生物制品公司），青霉素、鏈霉素、慶大霉素（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。
1.1.3 主要儀器：相差顯微鏡(Likon UFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培養(yǎng)箱(2300型SHELDON美國)，眼科顯微手術(shù)器材等。
1.2 方法
1.2.1 新鮮羊膜的制備：①羊膜取材：含抗生素（4 000 U/ml的慶大霉素、青霉素500 U/ml、鏈霉素500 μg/ml）PBS洗去胎盤的血凝塊，鈍性剝離羊膜，使其與絨毛膜分離，同時(shí)用含抗生素的PBS沖洗干凈后浸泡20 min，上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上。將上述附有羊膜的紙片修剪成2.5 cm×2.5 cm的小塊。PBS沖洗2次，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中DMEM/F12培養(yǎng)液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，無血清）浸泡備用，所制羊膜均于取材后12 h內(nèi)使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液37℃消化40 min，用細(xì)胞刮刀輕輕刮除上皮細(xì)胞，PBS清洗2次，相差顯微鏡下確認(rèn)上皮細(xì)胞全部清除。上皮面朝上鋪于蓋玻片（22 mm×22 mm）上置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。
1.2.2 兔角膜緣干細(xì)胞的原代培養(yǎng)（組織塊法培養(yǎng)）：空氣栓塞處死白兔，無菌條件下摘除眼球，去除角膜緣周圍的附屬組織，用含抗生素的PBS清洗3次，切取角膜緣組織，剪成1 mm3組織塊。用含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液消化15～20 min)，500 r/min離心后，棄去消化液，PBS清洗2次，將組織塊置于羊膜上，每孔3塊，間距0.5 cm，無菌靜置10 min。含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，3 d換液，之后每2 d換液1次，形成單層細(xì)胞膜片后用于鑒定或傳代。
1.2.3 角膜緣干細(xì)胞的傳代純化：相差顯微鏡下觀察，待組織塊生出的細(xì)胞形成單層膜片后，一般為8 d左右，將組織塊取出置于另一羊膜上繼續(xù)培養(yǎng)。PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶37℃消化2～3 min，含血清細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，輕輕吹打下的細(xì)胞收集入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×105copies/ml，接種于羊膜上，隔日換液，每2 d換液1次。如此傳代3次，去除纖維細(xì)胞。待細(xì)胞基本長滿后用于鑒定和移植。
1.2.4 角膜緣干細(xì)胞的鑒定［1］：免疫熒光鑒定：吸盡培養(yǎng)液，加入1 ml固定液，固定10 min。去固定液，用洗滌液洗3次，每次3～5 min，吸盡液體。用封閉液封閉60 min，在搖床上輕輕搖動(dòng)。去封閉液，用稀釋的一抗作用60 min，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。4℃作用過夜。去除一抗，用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min。去除洗滌液，加入1 ml稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗作用60 min，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)?；厥諢晒鈽?biāo)記的二抗，用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細(xì)胞接觸封片液，在熒光顯微鏡下觀察熒光。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞AE5和p63抗體染色陽性比例間比較采用χ2檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 相差顯微鏡下觀察，在羊膜上培養(yǎng)24 h，兔角膜緣組織塊邊緣可見有細(xì)胞爬出（圖1），大多為圓形、透明狀。之后形成“沙灘樣”移形帶，培養(yǎng)至7～8 d細(xì)胞形成單層膜狀（圖2），細(xì)胞透明，邊緣整齊，形態(tài)呈多樣化，以卵圓形和多邊形為主。若繼續(xù)培養(yǎng)至14 d左右，細(xì)胞成復(fù)層生長。
2.2 采用免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)的干細(xì)胞 AE5抗體染色陽性細(xì)胞質(zhì)呈紅色，陰性則不著色（圖3）；p63抗體染色陽性細(xì)胞核呈綠色（圖4）。羊膜上培養(yǎng)7 d的細(xì)胞AE5抗體陽性細(xì)胞比例為（41.72±11.35）%，p63抗體染色陽性細(xì)胞比例為（21.57±6.36）%。具體見表1。
2.3 傳代純化的角膜緣干細(xì)胞鑒定 經(jīng)傳代培養(yǎng)，與組織塊原代培養(yǎng)時(shí)相比，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)較規(guī)整，成纖維狀細(xì)胞明顯減少（圖5）。經(jīng)免疫熒光鑒定，2代AE5和p63陽性細(xì)胞比例與原代比較，無顯著性差異（P﹥0.05）；3代AE5和p63陽性細(xì)胞比例與原代比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），AE5陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖6），p63陽性細(xì)胞數(shù)增多（圖7）；但4代AE5陽性細(xì)胞比例又明顯升高。見表1。 表1 原代與傳代角膜緣干細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果比較
3 討論
組織工程化角膜是解決角膜移植供體來源最有前途的一個(gè)方法。載體是構(gòu)建組織工程化角膜上皮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，合適的載體應(yīng)可以促進(jìn)體外角膜緣干細(xì)胞的生長，同時(shí)又便于培養(yǎng)的細(xì)胞移植。羊膜為胎盤最內(nèi)層的半透明組織，研究表明，其作為角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)的載體并用于移植有許多優(yōu)點(diǎn)：①能為正常角膜上皮生長、移行創(chuàng)造良好的條件。羊膜是人體中最厚的基底膜，含有高濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和糖蛋白，有利于上皮細(xì)胞的分化、移行，并能加強(qiáng)基底上皮細(xì)胞的附著和防止上皮細(xì)胞凋亡。②免疫原性弱。羊膜不含HLAA、B、C及DR等抗原成分，移植后不被宿主排斥，且在體內(nèi)可降解［2］。③移植后可以阻止結(jié)膜化的發(fā)生。羊膜可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β等細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合中與成纖維細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)的信號(hào)下調(diào)，從而達(dá)到抗纖維化效果，減輕瘢痕形成。其中，TGFβ3還是干細(xì)胞生長的重要因子。④具有抗微生物特性，因此可降低移植術(shù)后感染的發(fā)生率。⑤羊膜還具有活躍的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，能允許一些小分子物質(zhì)如尿素、葡萄糖等通過。⑥羊膜來源廣泛，制備成本低。以上特點(diǎn)使羊膜被認(rèn)為是工程化角膜上皮的最佳載體［3］。本課題組采用去除上皮細(xì)胞的新鮮羊膜作為載體培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞，與其他文獻(xiàn)報(bào)道相比，細(xì)胞生長速度較快，24 h即可見有細(xì)胞長出，7～8 d匯合成單層膜狀。這可能與所用羊膜均為取材后12 h內(nèi)，與干細(xì)胞生長相關(guān)細(xì)胞因子含量豐富有關(guān)。
目前對(duì)角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物的研究已取得了一定的進(jìn)展，但仍然缺乏具有特異性的標(biāo)志物。Schermer等［4］的研究表明，K3蛋白是角膜上皮終末分化的標(biāo)志性角蛋白，未表達(dá)K3是角膜緣干細(xì)胞的標(biāo)志之一。Pellegrini等［5］證實(shí)角膜緣基底細(xì)胞抗p63抗體陽性，其他部位均陰性；能形成全克隆的細(xì)胞是干細(xì)胞，而全克隆細(xì)胞p63抗體陽性，故認(rèn)為p63是角膜上皮干細(xì)胞的特異標(biāo)志之一［6］。所以我們采用AE5抗體（K3抗體）和p63抗體行免疫熒光鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)7 d羊膜上的細(xì)胞膜片中AE5陰性細(xì)胞較多，說明角膜緣組織塊原代培養(yǎng)可獲得維持于低分化狀態(tài)的干細(xì)胞；而p63陽性細(xì)胞較多則說明細(xì)胞增殖能力很強(qiáng)。以新鮮羊膜為載體采用組織塊法培養(yǎng)角膜緣組織可得到含角膜緣干細(xì)胞的細(xì)胞膜片。3代AE5陰性細(xì)胞和p63陽性細(xì)胞比例明顯高于原代。
但是實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，角膜緣組織原代細(xì)胞中混雜有成纖維狀細(xì)胞和其他分化成熟的細(xì)胞，且增殖速度高于角膜緣干細(xì)胞，培養(yǎng)超過2周則載體全被成纖維狀細(xì)胞覆蓋。因不同細(xì)胞貼壁程度不同，因此我們利用不同的消化時(shí)間將培養(yǎng)細(xì)胞傳代克隆化，盡量去除成纖維狀和其他雜細(xì)胞。結(jié)果表明，夾雜于干細(xì)胞間的成纖維狀細(xì)胞明顯減少。而且在本實(shí)驗(yàn)條件下，原代細(xì)胞濃度為1×105copies/ml傳代，3代AE5陰性細(xì)胞和p63陽性細(xì)胞比例最多，角膜緣干細(xì)胞純度最高。但傳代超過4代，角膜緣干細(xì)胞大部分同時(shí)表達(dá)AE5和p63，說明干細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)分化。
參考文獻(xiàn)
［1］ 韓曉潔，龔嵐，余振鈺，等.人角膜緣干細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)和生物學(xué)鑒定［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2005，11(1)：13. ［2］ Schwab IR.Cultured corneal epithelia for ocular surface disease［J］.Trans Am Ophthalmol Soc， 1999， 9(7): 891986.
［3］ 夏涼，趙敏.角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)的載體研究概況及進(jìn)展［J］.中國實(shí)用眼科雜志，2005，23(12):12651268.
［4］ Schermer A， Galvin S， Sun TT．Differentiationrelated expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells［J］．J Cell Biol， 1986， 103(1): 4962.
組織工程一詞最早是由美國國家科學(xué)基金委員會(huì)于1987年正式提出和確定的，其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關(guān)的活細(xì)胞種植于天然的或人工合成的、具有良好生物相容性和生物降解性的細(xì)胞外基質(zhì)材料上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，將這種細(xì)胞生物材料復(fù)合體植入機(jī)體病損部位以形成新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。
組織工程的技術(shù)關(guān)鍵是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。這一三維空間為細(xì)胞的停泊、生長、繁衍、新陳代謝、新組織形成提供支持。作為組織工程細(xì)胞支架的生物材料應(yīng)具備以下特性：良好的細(xì)胞親和性；一定的孔徑和互相溝通的三維孔結(jié)構(gòu)；一定的幾何形狀；生物降解性，并最終被機(jī)體代謝或吸收。且支架的降解產(chǎn)物不對(duì)細(xì)胞繁殖產(chǎn)生不利的影響，其降解速度與細(xì)胞的增殖速度相匹配；一定的柔韌性，使之既能同機(jī)體組織縫合并貼合，又不會(huì)對(duì)機(jī)體組織造成機(jī)械損傷等。
近來，絲素蛋白這種天然高分子纖維蛋白已廣泛用于組織工程的研究。Altman等認(rèn)為絲素蛋白具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)與其他天然纖維和許多高性能合成纖維相比，有獨(dú)特的力學(xué)性能；(2)在外科領(lǐng)域的應(yīng)用已有很長歷史；(3)可以通過不同處理方法獲得膜或其他形態(tài)，而且工藝相對(duì)簡單；(4)可以通過某些氨基酸的氨基和側(cè)鏈的化學(xué)修飾較容易地改變表面性能；(5)在體內(nèi)外可以緩慢降解；(6)對(duì)生物體無危險(xiǎn)性。
本文綜述了近年來國內(nèi)外有關(guān)種子細(xì)胞在絲紊蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架方面的研究進(jìn)展以及應(yīng)用前景。
1 絲素蛋白在組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架方面的研究
1.1 軟骨細(xì)胞 關(guān)節(jié)軟骨損傷后其自身修復(fù)能力有限。近幾年絲素蛋白應(yīng)用于組織工程，為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)開拓了一個(gè)新的領(lǐng)域。日本京都大學(xué)和東邦大學(xué)(《國外紡織技術(shù)》2002年第6期)使用絲素蛋白培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞獲得成功。實(shí)驗(yàn)把絲素蛋白溶解在水里。加工成海綿狀，其小孔直徑約為80μm，然后把軟骨細(xì)胞“種植”在上面，在37℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，2周后海綿狀絲素蛋白的表面便再生出軟骨組織。上海醫(yī)科大學(xué)吳海濤等在2000年首次采用蠶絲與軟骨細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，探索了蠶絲作為軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架的可行性，他們將胰蛋白酶消化后的蠶絲任意纏繞成網(wǎng)狀，用聚乳酸活鼠尾膠進(jìn)行包埋，制成三維支架，觀察軟骨細(xì)胞生長情況，發(fā)現(xiàn)蠶絲對(duì)軟骨細(xì)胞具有良好的吸附作用，并能維持軟骨細(xì)胞正常形態(tài)和功能，是適合軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)的良好天然支架。
1.2 骨細(xì)胞 骨缺損的修復(fù)一直是骨組織工程中不斷深人研究的重要和熱門課題。治療骨缺損最理想的植骨材料就是自體骨，然而，自體骨移植存在骨源有限、取材不便，取骨處受到削弱，增大感染概率.增加患者痛苦，不適宜于老年人和少年兒童等諸多問題。因此，尋找一種自體骨的替代材料成為骨組織工程的當(dāng)務(wù)之急。Fini等應(yīng)用絲素蛋白水凝膠促進(jìn)兔松質(zhì)骨缺損動(dòng)物模型的組織修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12周后絲素蛋白水凝膠促進(jìn)松質(zhì)骨缺損的修復(fù)且沒有明顯的炎癥反應(yīng)。以上研究表明，絲素蛋白水凝膠應(yīng)用于承重骨骼的修復(fù)(如股骨、脛骨)具有廣闊的前景。
Kaplan等在把絲素蛋白支架材料用于骨組織工程方面作了很多研究。他們采用靜電紡的方法制得絲素蛋白纖維支架材料，在材料上復(fù)合BMP-2(骨形成蛋白)或HA(羥基磷灰石)顆粒，通過體外培養(yǎng)的方式觀察骨的形成。研究表明，BMP-2在絲素蛋白纖維材料上上具有生物活性，復(fù)合了BMP-2的絲素蛋白支架材料能支持鈣的沉積；絲素蛋白材料能支持hMSCs(人類骨髓間葉干細(xì)胞)的生長和分化，有利于骨形成；復(fù)合了HA的絲蛋白支架材料能夠促進(jìn)骨形成；復(fù)合了BMP-2和HA的支架材料能在很大程度上提高鈣的沉積和改善BMP－2的轉(zhuǎn)錄水平。這種加入促進(jìn)骨組織生長因子的支架材料是非常有潛力的骨組織工程材料，在支架材料中加入組織生長因子來促進(jìn)組織形成的方法也是今后組織工程支架材料的發(fā)展方向。此后，Kaplan等把復(fù)合了hMSCs的絲素蛋白支架材料用于體內(nèi)和體外培養(yǎng)，事實(shí)證明經(jīng)過體外培養(yǎng)的hMSCs／絲素蛋白復(fù)合支架材料具有良好的成骨能力，能夠治愈臨界尺寸的骨缺損。
1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓具有造血及成骨作用，分為造血和基質(zhì)兩個(gè)系統(tǒng)。骨髓基質(zhì)系統(tǒng)是指骨髓腔內(nèi)為造血系統(tǒng)提供結(jié)構(gòu)及功能支持的結(jié)締組織，含有少量的多能基質(zhì)干細(xì)胞，研究表明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在特定的條件下可以形成多種間充質(zhì)細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。
Altman等將絲素蛋白纖維經(jīng)特定的理化處理，在保證其抗拉強(qiáng)度下改善絲素蛋白纖維的彈性。形成接近于正常的前十字韌帶結(jié)構(gòu)的絲素蛋白基質(zhì)材料，研究發(fā)現(xiàn)處理加工后的絲素蛋白三維支架同樣支持間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和分化，與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)2周時(shí)檢測到韌帶形成相關(guān)蛋白(Ⅲ型膠原、I型膠原、黏蛋白c)的轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)，而成骨、成軟骨相關(guān)基因未見明顯改變，表明絲素蛋白支架促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞的分化，且3周內(nèi)未見絲素蛋白支架有明顯的機(jī)械強(qiáng)度改變。Gregory等用經(jīng)脫膠的家蠶絲素纖維制作人工十字韌帶。將人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BM―SC)種植于支架材料上進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增。掃描電鏡、DNA定量測試和膠原含量測試等研究結(jié)果顯示，此支架能支持人類干細(xì)胞向韌帶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)此絲素蛋白支架也具有良好的力學(xué)性能和緩慢的降解性，有望打破前十字韌帶臨床治療的局限性。
MeineI等和Kim等通過體內(nèi)外一系列實(shí)驗(yàn)研究了間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合三維的絲素蛋白支架修復(fù)骨缺損。當(dāng)培養(yǎng)基中加入含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)檢測到成骨相關(guān)基因的表達(dá)、免疫組織化學(xué)觀察到鈣沉積，同時(shí)發(fā)現(xiàn)接種于絲素蛋白支架上的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化明顯提高。5周以后發(fā)現(xiàn)骨小梁的形成，隨后將組織工程骨移植入骨缺損部位，同時(shí)移植接種間充質(zhì)干細(xì)胞的絲素蛋白支架組、單一的絲素蛋白支架組和無移植物的空白對(duì)照組作為對(duì)照，移植5周后，工程骨和接種間充質(zhì)干細(xì)胞的絲素蛋白支架組與周邊組織良好融合，骨鈣蛋白、骨橋蛋白染色呈陽性，工程骨組骨形成明顯高于接種間充質(zhì)干細(xì)胞的絲素蛋白支架組，骨小梁開始融合形成骨組織，類似于生理?xiàng)l件下的膜內(nèi)成骨。
1.4 其他種子細(xì)胞在絲素蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架方面應(yīng)用種子細(xì)胞在支架材料上黏附、代謝和增殖是組織工程研究的首要環(huán)節(jié)。Unger等報(bào)道了微孔的絲素蛋白無紡網(wǎng)材料能夠支持人上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的黏附、增殖、細(xì)胞間的相互作用等。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)如果預(yù)涂上纖維連接蛋白，則觀察到血管化作用中的內(nèi)皮化現(xiàn)象。楊新林等探討了人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在等離子體處理后的絲素蛋白膜表面的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SO2和NH3等離子體處理后，絲素蛋白膜表面分別被磺酸化和氨基化，并均能促進(jìn)HUVEC細(xì)胞生長，而且對(duì)細(xì)胞形態(tài)和產(chǎn)生凝血因子的功能沒有明顯的影響，認(rèn)為絲素蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞很好的培養(yǎng)基質(zhì)。
此外，絲素蛋白支架在肝細(xì)胞組織工程中的應(yīng)用也日益深入。KToyo take探討了人體肝細(xì)胞在絲素膜上的體外培養(yǎng)。在絲素膜上播種肝細(xì)胞24 h后，觀察到細(xì)胞沿基質(zhì)表面和內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作多重結(jié)構(gòu)的附著。谷一草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷一丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)化驗(yàn)結(jié)果顯示，接種1～7d，絲素膜上附著的肝細(xì)胞的COT和GPT活性值幾乎沒有降低，絲素膜上培養(yǎng)的肝細(xì)胞的氨處理能力和肝細(xì)胞白蛋白分泌能力也不低于目前最好的肝細(xì)胞培養(yǎng)基――膠原蛋白。另外，國內(nèi)外諸多人士將人體平滑肌細(xì)胞、海馬神經(jīng)元、嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、人類涎腺細(xì)胞植于化學(xué)修飾及改性的絲素蛋白材料，觀察到絲素蛋白膜上生長的細(xì)胞貼壁良好，生長狀況較好，證明了絲素蛋白材料具有良好的生物相容性。
2 前景展望
1. 下列有關(guān)基因及基因工程的敘述，正確的是（ ）
①基因是有遺傳效應(yīng)的DN段，全部位于染色體上
②檢測到受體細(xì)胞含有目的基因就標(biāo)志基因工程操作成功
③為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體
④每一個(gè)基因都包含特定的堿基序列，具有特異性
⑤人體內(nèi)的肝臟細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞所含的基因相同
A. ①②③ B. ③⑤ C. ②④ D. ④
2. 圖①表示限制酶切割某生物DNA分子的過程；圖②表示該生物體細(xì)胞部分基因和染色體的關(guān)系；該生物的黑色素產(chǎn)生需要如圖③所示的3類基因參與控制，三類基因的控制均表現(xiàn)為完全顯性。下列說法正確的是（ ）
A. 圖①所示限制酶能識(shí)別的堿基序列是TTAA，切點(diǎn)在G和A之間
B. 用限制性內(nèi)切酶可以從圖②所示基因型的細(xì)胞中提取合成黑色素的所有目的基因
C. 圖②所示的生物體中肯定存在含有2個(gè)a基因的細(xì)胞
D. 若圖③中的1個(gè)b基因突變?yōu)锽，則該生物體仍然可以合成出物質(zhì)乙
3. 下列關(guān)于哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育和胚胎工程的敘述，正確的是（ ）
A. 卵裂期胚胎中細(xì)胞數(shù)目和有機(jī)物總量在不斷增加
B. 胚胎分割時(shí)需將原腸胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割
C. 胚胎干細(xì)胞具有細(xì)胞核大、核仁小和蛋白質(zhì)合成旺盛等特點(diǎn)
D. 胚胎干細(xì)胞是一類未分化細(xì)胞，可從早期胚胎中分離獲取
4. 下列關(guān)于生物工程的敘述中，不正確的是（ ）
A. 利用胚胎移植技術(shù)，可以加快優(yōu)良種畜的繁育
B. 經(jīng)誘導(dǎo)融合得到的雜種細(xì)胞，需經(jīng)組織培養(yǎng)才能獲得雜種植株
C. 人工合成法獲得的人胰島基因與體內(nèi)該種基因的堿基排列順序可能不完全相同
D. 利用DNA探針可檢測出苯丙酮尿癥和21三體綜合征
5. 作物脫毒、改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)、抗除草劑作物、可保存的干擾素、檢測有毒物質(zhì)、性別鑒定依次是下列哪項(xiàng)生物技術(shù)的應(yīng)用（ ）
①基因工程 ②細(xì)胞工程 ③蛋白質(zhì)工程 ④胚胎工程
A. ②①①③②④ B. ①②②③④④
C. ②①②③②④ D. ②①②④③②
6. 下列與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的表述中，不正確的是（ ）
A. 用胰蛋白酶處理肝組織可獲得單個(gè)肝細(xì)胞
B. 培養(yǎng)液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等
C. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中多數(shù)細(xì)胞的基因型會(huì)發(fā)生改變
關(guān)鍵詞：人才培養(yǎng)模式；細(xì)胞工程技術(shù)；教學(xué)改革
中圖分類號(hào) G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）01-02-152-02
細(xì)胞工程是生物制藥工業(yè)中的關(guān)鍵技術(shù)，它是利用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增來生產(chǎn)生物產(chǎn)品，或者作為發(fā)現(xiàn)和測試新藥的工具[1]。就目前而言，高校細(xì)胞工程技術(shù)教學(xué)中還存在著一定的問題，如教學(xué)內(nèi)容陳舊，不適合生物類企業(yè)對(duì)職員的知識(shí)和技能需求；教學(xué)方法還停留在高等教育的初級(jí)階段，教學(xué)效果不高[2]等。因此，我們必須加快細(xì)胞工程技術(shù)類型人才培養(yǎng)模式的改革，進(jìn)行細(xì)胞工程技術(shù)教學(xué)模式和課程的改革與創(chuàng)新，通過有效的教育模式來提高教學(xué)質(zhì)量，讓學(xué)生既掌握細(xì)胞工程關(guān)鍵技術(shù)的基本理論和基本方法，又能掌握細(xì)胞工程學(xué)科技發(fā)展中產(chǎn)生的新技術(shù)、新方法，提高學(xué)生的創(chuàng)新能力。筆者從教學(xué)內(nèi)容與生產(chǎn)、雙語教學(xué)、生產(chǎn)學(xué)習(xí)與實(shí)驗(yàn)技能幾個(gè)方面對(duì)提高技能型人才培養(yǎng)目標(biāo)的教學(xué)模式進(jìn)行了探索研究，以期培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)能力、實(shí)踐能力、創(chuàng)新能力，全面提高教學(xué)的質(zhì)量和效率。
1 教學(xué)內(nèi)容與生產(chǎn)整合
細(xì)胞工程學(xué)課程內(nèi)容是按照細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)及其功能、相關(guān)技術(shù)講解的，課程包括細(xì)胞工程學(xué)發(fā)展史、細(xì)胞工程學(xué)概述、細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性、細(xì)胞融合、干細(xì)胞工程學(xué)、細(xì)胞克隆及克隆動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)等；考慮到細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在科研中普遍應(yīng)用，目前細(xì)胞工程學(xué)實(shí)驗(yàn)課另外開設(shè)了免疫組化、熒光細(xì)胞染色與細(xì)胞分選、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)、圖像處理等課程。
本科學(xué)習(xí)中，細(xì)胞工程學(xué)教學(xué)中主要以各種細(xì)胞培養(yǎng)為主要線索，了解細(xì)胞工程技術(shù)具有特定的研究方式，使得他們對(duì)細(xì)胞工程學(xué)有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)。例如，動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用于診斷和治療疾病的單克隆抗體生產(chǎn)，有幾千種單抗用于生化檢測，而單抗用于人體疾病治療是近幾年來生物制藥的一個(gè)重要領(lǐng)域，有幾十種單抗藥物正處于臨床試驗(yàn)中。通過實(shí)驗(yàn)，學(xué)生理解單克隆抗體生產(chǎn)制備技術(shù)，并掌握原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法、細(xì)胞融合和分選技術(shù)等方法和常用設(shè)備的使用方法，為以后的生產(chǎn)研究做好準(zhǔn)備。又如，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白都是胞外分泌的，產(chǎn)物的分離純化過程非常簡單，但是由于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)比較復(fù)雜，目前仍處于發(fā)展完善階段，因而許多重組蛋白仍選用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。我們針對(duì)這個(gè)特點(diǎn)，啟發(fā)同學(xué)設(shè)計(jì)較好的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)，如改裝的灌流式培養(yǎng)方式，培養(yǎng)和啟迪學(xué)生的創(chuàng)新思維。
2 普通教學(xué)與雙語教學(xué)整合
在當(dāng)前社會(huì)高速發(fā)展的時(shí)代，社會(huì)對(duì)細(xì)胞工程人才提出了更高的要求，尤其是生命科學(xué)院校畢業(yè)的學(xué)生能否跟上時(shí)代的步伐，面向世界進(jìn)行生物學(xué)的交流活動(dòng)，擴(kuò)大細(xì)胞工程技術(shù)在世界的影響，這是細(xì)胞工程技術(shù)發(fā)展至關(guān)重要的事。
在細(xì)胞工程學(xué)原版教材的選擇上要力求最基礎(chǔ)的專業(yè)知識(shí)內(nèi)容水平。我們選擇的教材是中國海洋大學(xué)出版社2011年10月第1版英文教程《CYTOTECHNOLOGY》，該教材的特點(diǎn)是講授的內(nèi)容比較全面，語法簡單，對(duì)專業(yè)性的概念、詞匯以及分子水平的知識(shí)進(jìn)行了淺顯的講解，比較適合用于高等院校學(xué)生進(jìn)行細(xì)胞工程專業(yè)外語的學(xué)習(xí)，避免學(xué)生由于英語基礎(chǔ)差，導(dǎo)致對(duì)抽象晦澀的細(xì)胞工程學(xué)課程雙語學(xué)習(xí)產(chǎn)生反感情緒，利于完成雙語教學(xué)工作。
3 生產(chǎn)學(xué)習(xí)與實(shí)驗(yàn)技能整合
學(xué)生創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的缺乏是高等教育教學(xué)改革面臨的問題[3]。因此，要帶領(lǐng)學(xué)生參與科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)技能，強(qiáng)化實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)。細(xì)胞工程技術(shù)實(shí)踐教學(xué)中，聯(lián)系生物制品企業(yè)生產(chǎn)學(xué)習(xí)很重要，如我們帶領(lǐng)學(xué)生到福瑞邦制藥的廠家參觀學(xué)習(xí)單抗制備，讓學(xué)生注意在實(shí)驗(yàn)操作中可能失敗的原因性，出現(xiàn)問題，及時(shí)加以糾正，培養(yǎng)學(xué)生良好的實(shí)踐能力。針對(duì)細(xì)胞工程學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，穿插設(shè)計(jì)探索性和綜合性的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并讓學(xué)生自己參與到實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的設(shè)計(jì)，并調(diào)動(dòng)學(xué)生的獨(dú)立思考能力和創(chuàng)新思維能力，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技能和創(chuàng)新思維能力。
實(shí)驗(yàn)大綱列出的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目較多，可整合為三大部分：（1）細(xì)胞培養(yǎng)綜合實(shí)驗(yàn)。包括培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞觀察，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)還可以將兔角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞種植于生物材料上進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長、排列和細(xì)胞的粘附情況等。（2）經(jīng)典單抗制備綜合實(shí)驗(yàn)。將單抗制備產(chǎn)生過程中的細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合，雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化，抗體檢測5個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容整合為1個(gè)單抗制備設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。教學(xué)中不為學(xué)生準(zhǔn)備傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)講義，只提出實(shí)驗(yàn)的任務(wù)、要求、進(jìn)度及安全注意事項(xiàng)等，重點(diǎn)突出學(xué)生自行完成相關(guān)資料查閱，自擬設(shè)計(jì)方案，自己安排時(shí)間完成實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。這個(gè)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃6個(gè)課時(shí)，2次課堂實(shí)驗(yàn)，分別以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、中期實(shí)驗(yàn)討論與交流、實(shí)驗(yàn)結(jié)果課件匯報(bào)為主要內(nèi)容。（3）流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞綜合實(shí)驗(yàn)。包括分選淋巴細(xì)胞或是干細(xì)胞的篩選，要求學(xué)生根據(jù)生產(chǎn)實(shí)踐需要（如奶牛細(xì)胞的分選、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分選等）自己選擇課題，自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法以及最后鑒定。這個(gè)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃12個(gè)課時(shí)，4次課堂實(shí)驗(yàn)，分別以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、中期實(shí)驗(yàn)討論、實(shí)驗(yàn)結(jié)果課件匯報(bào)為主要內(nèi)容。所有實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室全天性開放，學(xué)生可利用課余時(shí)間主動(dòng)完成各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作，老師指導(dǎo)，確保學(xué)生在30d內(nèi)獲得全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果。老師可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果反饋及時(shí)調(diào)整教學(xué)進(jìn)程和教學(xué)方法。通過學(xué)生的反饋，可以反映學(xué)生是否理解和掌握本課程的目標(biāo)，并加強(qiáng)了教師與學(xué)生之間的溝通，提高了教學(xué)效果。
參考文獻(xiàn)
[1]胡顯文，肖成祖.細(xì)胞工程在生物制藥工業(yè)中的地位[J].生物技術(shù)通訊，2001，12（2）：117-122.