發(fā)布時間：2024-01-02 10:36:44
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的細(xì)胞生物學(xué)研究樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
關(guān)鍵詞： 細(xì)胞生物學(xué) 考試方法 改革策略
細(xì)胞生物學(xué)作為生物學(xué)相關(guān)專業(yè)的基礎(chǔ)課程，其考核環(huán)節(jié)一直為我國高校相關(guān)專業(yè)所重視。傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)課程的考試環(huán)節(jié)主要以閉卷檢測作為考核方式，以考試分?jǐn)?shù)作為標(biāo)準(zhǔn)對學(xué)生的學(xué)習(xí)能力及學(xué)習(xí)成績進行評定。這種考核方法難以有效地反映學(xué)生的綜合素質(zhì)，因此對細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法進行改革具有一定的必要性。
一、細(xì)胞生物學(xué)課程考試改革的原則與思路
（一）考試方法改革原則
由于細(xì)胞生物學(xué)課程專業(yè)性及理論性較強，對該課程考試的改革應(yīng)以培養(yǎng)學(xué)生的自主創(chuàng)新能力及動手實踐能力作為切入點，根據(jù)學(xué)生的實際專業(yè)需求及個人能力的差異性對學(xué)生能力進行評價[1]。對專業(yè)成績的評述不應(yīng)單純地以閉卷理論試卷成績?yōu)樽罱K成績，應(yīng)當(dāng)綜合評價學(xué)生日常課堂表現(xiàn)、實驗課表現(xiàn)及課堂討論等環(huán)節(jié)表現(xiàn)出的能力，并對成績比例進行合理分配，具體考試方案由各專業(yè)教研部門自行確定。通過引入綜述論文、課堂發(fā)言、實驗課表現(xiàn)等環(huán)節(jié)的成績評定，可以有效提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。
（二）考試方法改革思路
對細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法的改革，主要將考試成績合理地劃分為“閉卷理論考試（60%）+論文綜述（10%）+實驗課表現(xiàn)（20%）+日常課堂表現(xiàn)（10%）”四個部分。
1.對學(xué)生日常課堂表現(xiàn)進行評價
學(xué)生的學(xué)習(xí)活動以課堂學(xué)習(xí)為主，因此對學(xué)生日常課堂表現(xiàn)進行客觀評價可以有效地反映學(xué)生細(xì)胞生物學(xué)課程的知識水平及能力基礎(chǔ)。因此，將細(xì)胞生物學(xué)課程考試成績中的10%作為日常課堂表現(xiàn)的分值，主要對學(xué)生課堂參與程度、討論問題積極性、師生互動與溝通、課堂出勤率等方面進行考察，從而有效地提高細(xì)胞生物學(xué)課程教學(xué)質(zhì)量。
2.對學(xué)生實驗課表現(xiàn)進行考核
細(xì)胞生物學(xué)課程主要由理論課及實踐課構(gòu)成，實踐課教學(xué)可以有效地對理論進行驗證，是學(xué)生深化理論、接觸生物學(xué)領(lǐng)域的重要途徑。傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)課程的考試主要側(cè)重期末閉卷考試的考試成績，對實驗課考核重視程度不足，導(dǎo)致絕大多數(shù)生物教師在教學(xué)過程中缺乏相應(yīng)的重視。將細(xì)胞生物學(xué)課程考試成績中的20%作為實驗課表現(xiàn)的分值，可以有效地提升學(xué)生實驗操作的積極性。
3.設(shè)計論文綜述環(huán)節(jié)進行考評
為了提升細(xì)胞生物學(xué)課程的考評的合理性，可以設(shè)計相應(yīng)的論文綜述環(huán)節(jié)，對學(xué)生整體知識結(jié)構(gòu)的掌握能力進行考核。論文綜述環(huán)節(jié)可以在考試周前一周至兩周進行，由教師提前布置相應(yīng)的論文論述主題，給予學(xué)生充足的時間撰寫論文、制作幻燈片，在考核過程中由學(xué)生自主上臺進行論文匯報，再由其他學(xué)生進行自主提問。在評分過程中，可以將細(xì)胞生物學(xué)課程考試成績中的10%作為論文綜述環(huán)節(jié)的分值。
二、細(xì)胞生物學(xué)課程考試改革應(yīng)注意的問題
（一）加強相關(guān)教師的素質(zhì)培訓(xùn)
隨著新課程改革的深化，雖然學(xué)生成為課堂教學(xué)活動的主體，但教師仍然處于主導(dǎo)者地位，教師的職業(yè)素質(zhì)及教學(xué)觀念直接影響細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的貫徹效果。因此，為了保證細(xì)胞生物學(xué)課程考試改革的有效性，我國高校相關(guān)專業(yè)應(yīng)當(dāng)開展周期性培訓(xùn)，培養(yǎng)生物教師相應(yīng)的職業(yè)素養(yǎng)，相關(guān)專業(yè)教研室應(yīng)根據(jù)教學(xué)活動的推進對教師進行跟蹤性的培訓(xùn)，積極開展教學(xué)前期培訓(xùn)、教學(xué)中期檢測及教學(xué)末期總結(jié)，保證生物教師可以明確細(xì)胞生物學(xué)考試方法改革的必要性，并從考試改革入手提高課堂教學(xué)質(zhì)量。
（二）貫徹落實相應(yīng)的考核操作
在明確了細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的原則與思路之后，應(yīng)當(dāng)將相應(yīng)的方案與思路落實到實踐中，用實踐檢驗理想化的方案，提高細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的合理性[2]。在實際考核操作過程中，教師應(yīng)當(dāng)制定相應(yīng)的規(guī)章制度明確相應(yīng)的考核流程，并對學(xué)生課堂表現(xiàn)、課堂出勤情況等評價因素進行了解。在實際考核過程中，可以打破傳統(tǒng)單一性由教師評價學(xué)生的教學(xué)模式，引入相應(yīng)的學(xué)生互評、學(xué)生自評評價機制，尊重學(xué)生實際能力的差異性，對學(xué)生成績進行合理的評估。
（三）在考核過程中加強教師的協(xié)作
由于細(xì)胞生物學(xué)課程考核具有較強的專業(yè)性及理論性，且考試改革涵蓋面與考察面較為廣泛，學(xué)生成績考核工作難以由一個教師單獨完成，因此應(yīng)當(dāng)以過程性目光看待細(xì)胞生物學(xué)課程考核工作，加強各環(huán)節(jié)教師的協(xié)作與溝通。在學(xué)生成績評價過程中，由不同的教師負(fù)責(zé)學(xué)生日常表現(xiàn)統(tǒng)計、學(xué)生論文綜述情況、學(xué)生試卷批閱等環(huán)節(jié)。在過程性評價中教師之間進行合理化分工，可以有效提升學(xué)生成績考核的合理性。
（四）引導(dǎo)學(xué)生注重日常學(xué)習(xí)過程
細(xì)胞生物學(xué)課程考核不僅具有檢測教學(xué)成果的功能，還具備評價功及引導(dǎo)功能[3]。傳統(tǒng)側(cè)重期末考試成績的考核模式對教學(xué)成果的評價較單一，很容易導(dǎo)致學(xué)生陷入學(xué)習(xí)時僅注重考點的學(xué)習(xí)誤區(qū)。對細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法的改革對學(xué)生日常表現(xiàn)、實驗課表現(xiàn)等方面進行綜合考核，因此教師應(yīng)當(dāng)注重引導(dǎo)學(xué)生的日常學(xué)習(xí)課程，盡可能地消除功利性的學(xué)習(xí)目的。
總而言之，細(xì)胞生物學(xué)不僅是一門集理論性、創(chuàng)造性為一體的學(xué)科，而且是臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的學(xué)科基礎(chǔ)。在教學(xué)考核過程中，相關(guān)教師應(yīng)當(dāng)明確考試的評價功能及引導(dǎo)功能，樹立素質(zhì)教育理念，利用多種形式的綜合性考核內(nèi)容對學(xué)生學(xué)習(xí)情況進行考評。
參考文獻：
[1]竇曉兵，高佳，范春雷，胡林峰，錢穎，沃興德.細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的研究與實踐[J].經(jīng)營管理者，2009，23：327.
[2]肖明珠，毛建文，李紅枝.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)考試方法的改革與實踐[J].中國現(xiàn)代教育裝備，2010，15：172-173.
[3]楊麗，張君，謝菁，徐文靜，王巖.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)考試方法改革的探討與實踐[J].教育教學(xué)論壇，2014，31：69-70.
[關(guān)鍵詞]RGD；人牙周膜細(xì)胞；黏附；增殖；堿性磷酸酶
[中圖分類號]Q813.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0054-03
The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell
BI Ying-chun，HE Yu-hong，XI Lan-lan
（Department of Stomatology，General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese，Jinan 250031，Shandong，China）
Abstract： Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine （RGDS） peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells（PDL） so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion，extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25～100mg/L（P
Key words：arginlie-glycine-aspartic；human periodontal ligament （PDL） cells； adhesion； proliferation； alkaline phosphatase
精氨酸 -甘氨酸-天門冬氨酸（Arg-Gly-Asp， RGD）三肽是多種細(xì)胞跨膜蛋白整合素的特異性配體，許多黏附蛋白所共有的細(xì)胞間及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)識別的最小序列，這一序列在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷徙和生長方面起重要作用。牙周膜細(xì)胞在牙根面上的附著和增殖是牙周組織新附著的關(guān)鍵，本實驗?zāi)康氖怯^察離體細(xì)胞培養(yǎng)條件下，外源性RGDS對牙周膜細(xì)胞的影響，為進一步的臨床研究工作提供實驗依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 材料：RGDS（Sigma）， 96孔培養(yǎng)板（Coster）， DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（FCS杭州四季青生物工程研究所）， 酶聯(lián)免疫檢測儀（DG3022A）， 牛血清白蛋白（BSA，博士德公司），噻唑鹽（MTT Sigma），ALP試劑盒，倒置顯微鏡（Olympus，Japan）。
1.2 人PDL的體外培養(yǎng)：取13～17歲因正畸需要拔除的新鮮前磨牙，隨即在無菌條件下用PBS緩沖液（含青、鏈霉素各1000U/ml）浸泡5～10min，并沖洗2次，除去血液，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1mm3碎塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，瓶底向上，加入適量含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在飽和濕度、50ml/LCO2、950ml/L空氣、37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育2h，翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)至長出牙周膜細(xì)胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法進行傳代，用免疫組化SABC法進行角蛋白和波形絲蛋白染色，波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源。取第4代細(xì)胞用于實驗。
1.3 PDL細(xì)胞黏附性的測試--固相結(jié)合分析[1]：將RGDS溶于PBS液，分別制成100mg/L，50mg/L， 25mg/L，12.5mg/L4種濃度，每濃度為一實驗組。將各濃度組按每孔50μl包被96孔板，每種濃度4孔，陰性對照為10g/L BSA。將96孔板置于4℃，過夜。用PBS液洗96孔板各孔2次，加10g/L BSA，37℃封閉1h，PBS再洗2次。取第4代人PDL細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化，離心，收集細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液吹懸細(xì)胞，形成5×108/L的細(xì)胞懸液，以每孔100μl接種于96孔板，37℃，50ml/LCO2條件下培養(yǎng)120min。取出培養(yǎng)板，PBS洗2次以去除未貼壁的細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化，離心，將細(xì)胞懸浮于200μl無血清DMEM，血球計數(shù)板進行細(xì)胞計數(shù)，計算細(xì)胞總量。
1.4 PDL細(xì)胞伸展性的測試：實驗分組及96孔板的包被與實驗方法1.3相同，用無血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至107/L，每孔接種100μl， 標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育120min，倒置顯微鏡下觀察各孔并照相。計數(shù)伸展細(xì)胞（即至少有一個胞漿突起的細(xì)胞）數(shù)和未伸展細(xì)胞數(shù)，每組至少計數(shù)100個細(xì)胞，計算伸展細(xì)胞的百分率。
1.5 RGDS對PDL細(xì)胞增殖的影響：實驗分組及96孔板的包被與實驗方法1.3相同，用無血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至107/L，每孔100μl接種于96孔板，10ml/LDMEM培養(yǎng)24h后，PBS 洗去未黏附細(xì)胞，重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl，將96孔板置37℃、50ml/LCO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天后，MTT法測不同濃度RDGS對PDL細(xì)胞的影響。
1.6 RGDS對PDL細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的影響：將PDL細(xì)胞按1.5的方法培養(yǎng)5天后， PBS洗3次，每孔加1ml/L TritonX-100 50μl，4℃過夜。次日每孔加堿性磷酸酶抗體100μl，37℃、50ml/LCO2孵育30min，加0.2mol/LNaOH 50μl終止反應(yīng)。酶聯(lián)免疫檢測儀410nm檢測A值。
1.7 數(shù)據(jù)分析：運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS10.0進行組間t檢驗， P
2 結(jié)果
2.1 RGDS對PDL細(xì)胞黏附性和伸展性的影響：如表1所示，隨著RGDS濃度增加，其促進PDL細(xì)胞的黏附率的作用逐漸增強，當(dāng)濃度為12.5mg/L時，與對照組相比較，既有促進細(xì)胞黏附作用（P
細(xì)胞伸展性實驗也說明，在RGDS濃度為12.5mg/L時，即有促進細(xì)胞伸展功能（P
2.2 RGDS對PDL細(xì)胞增殖和ALP的影響：RGDS在50～100mg/L可明顯促進細(xì)胞增殖，濃度在25～100mg/L明顯提高HPDL細(xì)胞的ALP的活性。見表2。
3 討論
本實驗運用固相結(jié)合分析技術(shù)，將RGDS固定于96孔板上，為排除血清中某些因素對實驗結(jié)果的影響，在黏附和伸展實驗中采用無血清的DMEM，在增殖和ALP活性檢測時，因培養(yǎng)時間較長（5天），采用細(xì)胞能耐受的1%胎牛血清濃度。實驗結(jié)果顯示：在濃度為25mg/L可顯著促進PDL細(xì)胞的黏附、伸展，而較高濃度的促進作用卻不明顯，可能在此濃度時細(xì)胞膜上受置已飽和，再增加RGDS并不能使黏附率明顯上升。而細(xì)胞伸展性也顯示，當(dāng)RGDS濃度達到25mg/L時，細(xì)胞在2h的伸展率達到了50%以上，倒置顯微鏡下可見經(jīng)RGDS處理過的細(xì)胞胞體呈梭行或多角性，既細(xì)胞有一個以上的突起，呈現(xiàn)良好的伸展?fàn)顟B(tài)。而未經(jīng)RGDS處理的對照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形，無突起或僅有少量突起，細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)不佳。
精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）是細(xì)胞外基質(zhì)中許多黏附蛋白所共同含有的一個三肽序列，它是黏附蛋白與細(xì)胞表面特異受體蛋白相互作用的識別位點。這些細(xì)胞表面膜蛋白被稱為整合素（integrin）。整合素家族的分子都是由α、β兩條鏈由非共價鍵連接組成的異源雙體，為一跨膜結(jié)構(gòu)，一端連接細(xì)胞內(nèi)的骨架系統(tǒng)，另一端通過RGD識別位點與細(xì)胞外基質(zhì)連接，形成配體-整合素-細(xì)胞骨架跨膜信息系統(tǒng)，從而將細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架連接起來，引起細(xì)胞內(nèi)一系列生化改變：如：酪氨酸磷酸化、胞漿堿化、鈣離子濃度提高、大量磷脂代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等，進而影響多種組織細(xì)胞功能調(diào)控，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞的伸展、移動、生長、分化、血栓形成、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要生理病理過程[2-3]。1984年，Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用實驗證實RGDS是纖維連接蛋白與其受體的特異性結(jié)合位點，可促進鼠腎成纖維細(xì)胞在生物材料表面的黏附，從此對于RGD配體與受體相互作用機制的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。許多學(xué)者[5]研究了RGD與生物材料的不同結(jié)合對細(xì)胞在粘附、增殖、遷徙等方面的影響，顯示RGD與材料表面的穩(wěn)定的連接是促進細(xì)胞粘附、增殖的關(guān)鍵。
ALP是參與骨等硬組織形成﹑代謝﹑再生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，它通過水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸鹽，能去除鈣化抑制物，提供能量，促進鈣化[6]。同時ALP也是細(xì)胞分化活躍和具有成骨能力的標(biāo)志之一[7]。而牙周膜細(xì)胞具骨母樣細(xì)胞特性，ALP也是牙周膜細(xì)胞分化和向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的先決條件。本實驗中，RGDS在濃度25mg/L即可提高牙周膜細(xì)胞ALP水平，這可能是RGDS通過激活整合素受體蛋白，引起胞內(nèi)細(xì)胞骨架改變，從而促進細(xì)胞貼壁、伸展，進而促進細(xì)胞增殖，使其分化提前，因此ALP水平的提高極可能是由于牙周膜細(xì)胞數(shù)量增加引起，但無論什么原因，RGDS這種促增殖與分化的作用在牙周組織修復(fù)過程中具有重要意義。
牙周組織再生的一個中心環(huán)節(jié)是牙槽骨和牙骨質(zhì)的重建及功能性牙周膜的完全再生，即形成牙周新附著，而PDL細(xì)胞作為具有異質(zhì)性的多能干細(xì)胞，其在根面上的黏附、生長、分化是形成新附著的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果證實RGDS可有效促進PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有學(xué)者將含有RGD的七肽固定于I型膠原材料，PDL粘附率明顯提高[8]。因而如果將RGD應(yīng)用于引導(dǎo)牙周組織再生的過程中，則有可能促進PDL細(xì)胞在根面上黏附、伸展，激活PDL細(xì)胞成骨功能，促進牙周組織再生，這對體內(nèi)應(yīng)用RGDS促進牙周新附著的形成有一定的指導(dǎo)意義。
[參考文獻]
[1]Horiuchi K，Amizuka N，Takeshita S，et al.Identification and characterization of a novel protein， periostin， with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta[J].J Bone Miner Res，1999，14：1239-1249.
[2]Hynes RO.Integrins：versatility，modulation，and signaling in cell adhesion[J].Cell，1992 Apr 3，69（1）：11-25.
[3]Clark EA， Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways： the road taken. [J].J Science，1995，268：233-238.
[4]Pierschbacher M D，Ruolslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule[J].Nature，1984，309：30-33.
[5]Hersel U，Dahmen C，Kessler H.RGD modified polymers：biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond[J]. Biomaterials，2003，24（24）：4385-4415.
[6]Quarles LD，Yohay DA，Lever LW，et al.Distinct proliferative and bydifferentiated stages of murine MC3T3-E1 cell in culture：an in vitro model of osteoblast development[J]. J Bone Miner Res，1992，7（6）：683-687.
摘要從教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)過程和考核方式等方面介紹了研究生細(xì)胞分子生物學(xué)課程的教學(xué)開展與體會，為適應(yīng)多研究方向的研究生培養(yǎng)要求、提高教學(xué)效果提供參考。
關(guān)鍵詞研究生;細(xì)胞分子生物學(xué);教學(xué);內(nèi)容;考核
揚州大學(xué)碩士研究生培養(yǎng)方案課程設(shè)置將細(xì)胞分子生物學(xué)作為生物學(xué)一級學(xué)科的學(xué)位課程，包含植物學(xué)、動物學(xué)、生理學(xué)、水生生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、生物物理學(xué)、生態(tài)學(xué)等11個生物學(xué)二級學(xué)科。揚州大學(xué)是江蘇省屬重點綜合性大學(xué)，目前設(shè)有27個學(xué)院，11個生物學(xué)二級學(xué)科分散在生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、農(nóng)學(xué)院、獸醫(yī)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，各二級學(xué)科的研究方向也較廣泛，如何適應(yīng)這種多學(xué)院、多學(xué)科和多研究方向的碩士研究生培養(yǎng)要求，提高教學(xué)效果，揚州大學(xué)不斷進行嘗試、改革，構(gòu)建了適合各二級學(xué)科培養(yǎng)目標(biāo)要求的細(xì)胞分子生物學(xué)教學(xué)體系，現(xiàn)將這門課程的教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)過程和考核方式介紹如下。
1細(xì)胞分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容
細(xì)胞分子生物學(xué)是隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)展而興起的一門較新的學(xué)科，是一門在分子水平上研究基因?qū)?xì)胞活動調(diào)控以及各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成和功能執(zhí)行的科學(xué)[1]。對生物學(xué)專業(yè)的研究生來講，本科階段都學(xué)過細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)這2門課程，因此研究生所開設(shè)的細(xì)胞分子生物學(xué)課程體系應(yīng)該和本科生的課程體系有所區(qū)別。由于傳統(tǒng)的細(xì)胞分子生物學(xué)教材與細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)在內(nèi)容上有很多雷同，若采用這些教材，很容易使研究生對該門課程失去興趣。揚州大學(xué)將該門課程的教學(xué)內(nèi)容分為4個部分:細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遺傳、細(xì)胞代謝與調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育，該校沒有選擇任何固定教材，僅僅指定少數(shù)最新出版的教材作為參考書，如韓貽仁主編的分子細(xì)胞生物學(xué)[2]、Gerald Karp主編的Cell and Molecular Biology:Concepts and Experi-ments等[3]。
2細(xì)胞分子生物學(xué)的教學(xué)過程
揚州大學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)的授課對象差異比較大，學(xué)生的來源和專業(yè)背景也不同，在教學(xué)過程中，筆者嘗試使用開放式教師、開放式教學(xué)和開放式課堂的教學(xué)方法。
2.1開放式教師
以往的研究生課程都是由固定的教師一上到底，由于教師的精力有限，不可能對細(xì)胞生物學(xué)各個領(lǐng)域的前沿知識都熟悉。為了解決這一問題，揚州大學(xué)采用不固定教師上課的制度，跨學(xué)科跨學(xué)院請資深教師進行授課，確保學(xué)生能夠了解該領(lǐng)域的基本知識與前沿動態(tài)。設(shè)置的4個部分教學(xué)內(nèi)容中，每一部分由1~2位專業(yè)教師負(fù)責(zé)主講，教師可結(jié)合自己的專業(yè)背景，根據(jù)不同教學(xué)模塊，設(shè)置具體的教學(xué)內(nèi)容，不拘泥于任何教科書進行授課。有些教師的研究方向是植物，對植物細(xì)胞分子生物學(xué)的研究進展和前沿動態(tài)比較熟悉，講授植物細(xì)胞分子生物學(xué)可以做到深入淺出，而對動物細(xì)胞分子生物學(xué)的講授效果會比較差，因此主講教師可選擇來自植物、動物、微生物、病毒等研究方向的老師。對于學(xué)生，有些是來源于農(nóng)學(xué)院，其背景知識和興趣側(cè)重在植物方面，而有些來源于醫(yī)學(xué)院或獸醫(yī)學(xué)院，其背景知識和興趣側(cè)重在動物方面，這就要求選擇具有不同學(xué)科背景的教師。開展開放式的教學(xué)方式，滿足不同學(xué)生的要求。
2.2開放式教學(xué)
由于細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科之一，因此在把握現(xiàn)有教材和參考資料的基礎(chǔ)上，教學(xué)過程中要結(jié)合實際將細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的新進展、新知識、新方法介紹給學(xué)生，拓寬學(xué)生知識的深度、廣度，培養(yǎng)其對未來工作的適應(yīng)能力。
在每一個教學(xué)模塊中，教師可通過不同的教學(xué)方式講解不同側(cè)重點的專題。如細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分包括講了2個專題，一個是細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng):結(jié)構(gòu)、功能、蛋白質(zhì)分選和膜泡運輸，另一個是細(xì)胞骨架與細(xì)胞運動。內(nèi)膜系統(tǒng)一般是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核、溶酶體和液泡(包括內(nèi)體和分泌泡)5類細(xì)胞器膜的總稱，而廣義的內(nèi)膜系統(tǒng)概念也包括線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、細(xì)胞核等細(xì)胞內(nèi)所有細(xì)胞器膜的總稱。在本科細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)過程中，這些細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)生是分別獨立介紹。雖然這些細(xì)胞器具有各自獨立的結(jié)構(gòu)和功能[4]，但它們又是密切相關(guān)的，尤其是它們的膜結(jié)構(gòu)是可以相互轉(zhuǎn)換的，轉(zhuǎn)換的機制則是通過蛋白質(zhì)分選和膜泡運輸來實現(xiàn)的。在講授內(nèi)膜系統(tǒng)時，可通過蛋白質(zhì)合成這條線將這些相關(guān)內(nèi)容串聯(lián)起來講述。由于核糖體在蛋白質(zhì)合成上與內(nèi)膜系統(tǒng)互為一體，因此將核糖體也加入進來，同時向上講可以提及細(xì)胞核中核糖體大小亞基及mRNA的合成，向下還可講述細(xì)胞膜上的蛋白功能，從而用蛋白質(zhì)合成一條線將細(xì)胞的三大結(jié)構(gòu)即細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核聯(lián)系了起來。同時，也啟迪研究生自己去找線索，找出一根主干，將盡可能多的內(nèi)容串起來。又如細(xì)胞骨架對于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性以及在細(xì)胞運動、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞和細(xì)胞分化分裂等一系列方面起重要作用，因此對細(xì)胞骨架的研究是近代生命科學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域之一，它的快速發(fā)展主要得益于大型分析儀器的應(yīng)用和實驗方法技術(shù)的改進。在這一部分內(nèi)容的教學(xué)中，可重點向?qū)W生講解細(xì)胞骨架的研究方法，包括每種方法的原理、基本過程和結(jié)果分析，以最新的國外權(quán)威期刊上發(fā)表的細(xì)胞骨架方面的論文為例，向?qū)W生介紹細(xì)胞骨架的研究是如何開展的。
2.3開放式課堂
研究生課堂和本科生課堂相比，講授內(nèi)容量非常大。筆者一般會在課后將課件提供給學(xué)生，使他們在課堂上不用花太多精力記筆記，而是將主要精力集中到聽課上，跟著教師的引導(dǎo)考慮問題，這樣使其思維保持很高的興奮度，且感到疲勞。在嚴(yán)格遵守課堂紀(jì)律的前提下，在上課時要盡量調(diào)動學(xué)生的積極性，以開拓學(xué)生的思維，培養(yǎng)創(chuàng)造性。課后要讓學(xué)生自己閱讀指定或推薦的原始文獻，或者讓他們自己到網(wǎng)上查閱自己感興趣的問題，以此可培養(yǎng)學(xué)生閱讀文獻、查找資料、進行科研的能力。
3細(xì)胞分子生物學(xué)的考核方式
作為生物學(xué)一級學(xué)科碩士研究生的學(xué)位課程，細(xì)胞分子生物學(xué)的考核以考試為主，考慮到研究生學(xué)習(xí)細(xì)胞分子生物學(xué)課的目的主要是為了提高學(xué)生利用學(xué)到的細(xì)胞生物學(xué)知識解決課題研究中的問題，實用性較強，因此筆者選用開卷考試的形式，所出的試題都是綜合性的分析題，在考場內(nèi)學(xué)生可以查閱任何參考資料，但參考資料中沒有現(xiàn)成的答案，促使學(xué)生綜合運用所學(xué)知識，通過仔細(xì)分析才能得出答案。這種考核方式一方面提高了學(xué)生獨立思考問題和解決問題的能力，另一方面也使教師了解了學(xué)生對這門課程的掌握情況，檢驗教學(xué)質(zhì)量，很大程度上促進了以后教學(xué)的開展。
4參考文獻
[1] 王石平，金安江.分子細(xì)胞生物學(xué)研究性教學(xué)模式的改革實踐與思考[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:社會科學(xué)版，2008(2):134-137.
[2] 韓貽仁.分子細(xì)胞生物學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社，2001.
與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，全文就目前國內(nèi)外對膀胱移行細(xì)胞癌分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究概況作一綜述。
【關(guān)鍵詞】 膀胱移行細(xì)胞癌 標(biāo)志物 分子生物學(xué) 免疫學(xué)
膀胱移行細(xì)胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易復(fù)發(fā)性，腫瘤細(xì)胞易于種植轉(zhuǎn)移，臨床上僅根據(jù)腫瘤病理判斷預(yù)后較為困難。鑒于此，目前對其分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究愈來愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文獻報道分析了相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)記物與泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤的病理分級、臨床分期、復(fù)發(fā)及生存率的關(guān)系，為診斷腫瘤、制定正確的治療方案及判斷預(yù)后等提供重要的信息，本文就目前已報道的分子生物學(xué)標(biāo)記物作一綜述。
1 癌基因與抑癌基因
1.1 p53
p53的突變或丟失在膀胱癌的檢出率為50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年齡膀胱癌患者的p53表達，發(fā)現(xiàn)p53異常表達在小于45歲的膀胱癌患者更為常見。大量研究表明，p53的改變與膀胱癌的分期、分級、侵襲性有關(guān)，但其是否與膀胱癌的復(fù)發(fā)及生存率相關(guān)仍有爭議。Yeniyol等[2]采用免疫組化檢測48例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本中p53的表達，p53異常表達在不同臨床分期和病理分級間差異顯著，但未發(fā)現(xiàn)p53陽性組與陰性組腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率有明顯差異。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出類似的結(jié)論。但另有多篇文獻報道，p53與膀胱癌的復(fù)發(fā)率和死亡率顯著相關(guān)。Sanchez等[4]報道復(fù)發(fā)的膀胱癌（n＝47）p53的異常表達明顯高于未復(fù)發(fā)者，p53的異常表達與膀胱癌的進展和生存率相關(guān)。Wolf等報道p53異常表達與pT1G3膀胱癌（n＝30）的預(yù)后關(guān)系密切。
p53突變可能與膀胱原位癌（CIS）的生物學(xué)行為有關(guān)，導(dǎo)致CIS的侵襲性增加，Shariat等[5]檢測47例膀胱CIS的p53及其中39例標(biāo)本的p21表達，p53/p21聯(lián)合分析顯示出與腫瘤的復(fù)發(fā)、進展及生存率之間密切的相關(guān)性，p53（+）/p21（+）患者腫瘤復(fù)發(fā)進展和死亡的危險程度遠(yuǎn)大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。
1.2 p21
關(guān)于p21與膀胱癌的報道結(jié)果并不統(tǒng)一，Chatterjee等[6]檢測p53、p21、pRb在164例TCC標(biāo)本中的表達，結(jié)果顯示p53、p21、pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)率和5年生存率的獨立因子，三者聯(lián)合分析顯示出與TCC預(yù)后之間良好的相關(guān)性。Kuczyk MA等也認(rèn)為p21WAF/CIP1可以作為判斷膀胱癌生存率的獨立預(yù)后因子。Liukkonen等[7]檢測207例膀胱癌(pTa～pT1)標(biāo)本中p21WAF1/CIP1和細(xì)胞周期素D1的表達，平均隨訪4.9年，分析其與腫瘤分期、分級、細(xì)胞增殖率（MIB?鄄1指數(shù)）、p53、bcl?鄄2、生存率的關(guān)系。結(jié)果只有MIB?鄄1指數(shù)與無瘤生存率顯著相關(guān)（P=0.03），腫瘤復(fù)發(fā)率只與腫瘤分級（P=0.002）和細(xì)胞周期素D1的表達相關(guān)（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1與其他因子相比預(yù)后作用較小，有關(guān)p21WAF1/CIP1在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義有待進一步闡明。
1.3 p16 /CDKN2A
Hitchings等[8]檢測78例TCC 標(biāo)本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表達，多因素分析顯示任何兩者的改變與腫瘤的進展密切相關(guān)，p53和 p16同時表達異常者腫瘤的進展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用來判斷pTa～pT1期膀胱腫瘤的進展情況。Benedict等發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)本中p16/CDKN2A的表達與Rb的表達呈負(fù)相關(guān)，Rb強染色的標(biāo)本罕見p16陽性染色，同時，伴染色體9p21的雜合丟失的腫瘤p16/CDKN2A失表達，Rb強表達。Primdahl等發(fā)現(xiàn)初診即為浸潤型膀胱癌p16/CDKN2A的表達顯著低于繼發(fā)于Ta 或T1的浸潤期腫瘤，有關(guān)進一步解釋尚待研究。
1.4 Rb
Sanchez Zalabardo D等[4]隨訪47例浸潤型膀胱癌患者，發(fā)現(xiàn)Rb表達異常的患者腫瘤進展速度、復(fù)發(fā)率顯著升高。Sunanda等檢測164例TCC標(biāo)本pRb的表達，得出結(jié)論pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)和生存率的獨立預(yù)后因子。另有報道對45例T1期膀胱腫瘤患者隨訪發(fā)現(xiàn)Rb基因的丟失與pRb的異常表達明顯導(dǎo)致患者無瘤生存率降低，此外，多篇文獻報道Rb在與p21、p16、Ki67、p53等聯(lián)合判斷膀胱癌預(yù)后時表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，可作為較理想預(yù)后因子。
2 細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)
細(xì)胞核相關(guān)抗原（Ki67）是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物，可通過單克隆抗體MIB?鄄1檢測，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的重要意義被越來越多的作者證實。Migaldi等發(fā)現(xiàn)老年患者膀胱癌標(biāo)本MIB?鄄1指數(shù)高于年輕者，并且與膀胱癌復(fù)發(fā)率、生存率密切相關(guān)[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究發(fā)現(xiàn)Ki67是膀胱癌良好的獨立預(yù)后因子。
Frank等[10]選取伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的尿道膀胱腫瘤139例，手術(shù)切除腫瘤并行化療，隨訪分析p53和MIB?鄄1在判斷腫瘤預(yù)后及化療療效中的作用，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)p53和MIB?鄄1與該類腫瘤患者的預(yù)后具有顯著性相關(guān)，但MIB?鄄1指數(shù)與腫瘤的化療療效呈顯著負(fù)相關(guān)，提示MIB?鄄1可以作為判斷膀胱癌化療療效的指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。同樣，Matsumoto等對62例膀胱移行細(xì)胞癌（pT1G3～pT4M0）標(biāo)本進行類似研究，平均隨訪34個月，發(fā)現(xiàn)Ki67的表達與腫瘤化療完全緩解率顯著性相關(guān)，能較好地判斷療效。
3 細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)
3.1 bcl?鄄2/bax
bcl?鄄2被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax屬于凋亡調(diào)控基因bcl?鄄2 基因家族， 分別能夠阻遏和促進凋亡， bax?鄄bax同源二聚體促進凋亡，bcl?鄄2?鄄bax異聚體阻遏凋亡，突變的p53蛋白可起到與bcl?鄄2蛋白類似的作用，并抑制bax基因的轉(zhuǎn)錄，進而抑制凋亡。
Uchida T等觀察到119例膀胱癌患者中p53的表達與腫瘤分期分級相關(guān)，bcl?鄄2表達與腫瘤臨床病理特征無關(guān)，但p53和bcl?鄄2同時過表達提示不良預(yù)后[11]。Wolf、Gazzaniga等也證實bcl?鄄2的表達與腫瘤復(fù)發(fā)率和無瘤生存率明顯相關(guān)。但 Asci R等[12]報道年齡小于40歲患者TCC細(xì)胞漿bcl?鄄2和p53的表達分別為54%、37%，與腫瘤的進展無明顯相關(guān)。同樣，F(xiàn)raile、Stavropoulos等報道bcl?鄄2的表達與膀胱癌的分期、分級及復(fù)發(fā)率無明顯相關(guān)，提示有關(guān)bcl?鄄2的作用仍需進一步研究。
3.2 Fas/FasL
Fas與FasL都是跨膜蛋白，分別屬于TNF受體和TNF家族，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化可導(dǎo)致細(xì)胞表面FasL被激活，與Fas結(jié)合，使表達Fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Lee SH等檢測37例膀胱癌標(biāo)本，F(xiàn)as/FasL的高表達達到92％。Lee等報道43例膀胱腫瘤標(biāo)本28％有Fas基因的突變。目前對血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究較多，Mizutani等[13]報道sFas或sFasL的升高預(yù)示Ta期膀胱癌患者早期復(fù)發(fā)的可能，sFas或sFasL可作為判斷Ta期膀胱癌復(fù)況的預(yù)后因子。
4 血管形成因子
4.1 VEGF
與大多數(shù)實體瘤一樣，膀胱癌的形成也具有血管形成依賴性，與血管內(nèi)皮生長因子VEGF關(guān)系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧誘導(dǎo)因子(HIF?鄄1α)之間的關(guān)系及兩者在TCC中的預(yù)后意義，結(jié)果顯示HIF?鄄1α與腫瘤病理分級顯著相關(guān)，VEGF和微血管密度（MVD）與腫瘤分級和臨床分期顯著相關(guān)。HIF?鄄1α與VEGF和MVD顯著相關(guān)，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良。同樣，Santos（n＝66）也報道VEGF可作為判斷膀胱上皮腫瘤的預(yù)后因子。
4.2 血栓黏合素?鄄1
血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白，分子量為430kD。TSP?鄄1被認(rèn)為是惟一抑制腫瘤血管形成的物質(zhì)。Grossfeld等[15]分析了163例TCC標(biāo)本TSP?鄄1、p53的表達與TCC復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系，TSP?鄄1表達與TCC復(fù)發(fā) （P=0.009）和生存率（P=0.023) 顯著相關(guān)，低表達TSP?鄄1患者腫瘤復(fù)發(fā)率增高，生存率降低。
5 生長因子及受體
5.1 EGFR
EGFR在眾多上皮腫瘤中有較高的陽性表達，Colquhoun等[16]綜述了近年來有關(guān)EGFR與膀胱癌的研究，得出結(jié)論EGFR的表達與膀胱癌的分期、分級、復(fù)發(fā)率、無瘤生存率明顯相關(guān)，EGFR過表達提示腫瘤預(yù)后不佳，使用抑制EGFR活性的物質(zhì)如ZD 1839等可望成為臨床治療膀胱癌等的新手段。
5.2 TGFα
TGFα在膀胱癌中的表達顯著高于正常膀胱組織，Ravery等報道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表達，且與腫瘤死亡率顯著相關(guān)。Ravery等分析28例早期膀胱腫瘤TGFα?鄄mRNA的表達，隨訪兩年發(fā)現(xiàn)其與腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，對判斷早期膀胱腫瘤的預(yù)后有重要價值。Thogersen等則報道TGFα與EGFR的表達相關(guān)，但與患者生存率無明顯相關(guān)，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的作用有待研究。
6 細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞黏附分子
6.1 MMPs
Hara等[17]分析51例表淺TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)與腫瘤復(fù)發(fā)率間的關(guān)系，復(fù)發(fā)組MMP?鄄9的表達是未復(fù)發(fā)組的2.5倍，未發(fā)現(xiàn)MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表達的差異，MMP?鄄9高表達組無瘤生存率顯著低于正常表達組。同樣，Ozdemir等檢測60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表達，發(fā)現(xiàn)只有MMP?鄄9的表達與腫瘤的分期分級相關(guān)。Papathoma等報道隨著尿路上皮腫瘤分級和浸潤程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表達顯著升高，但兩者與腫瘤的復(fù)發(fā)率無明顯相關(guān)，提示其在判斷膀胱癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的意義仍有待研究。
6.2 E?鄄鈣黏蛋白
E?鄄鈣黏蛋白的表達與腫瘤分化、癌細(xì)胞侵襲能力及轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。Shahrokh等檢測53例膀胱CIS標(biāo)本E?鄄鈣黏蛋白的表達，隨訪131個月，多因素分析表明E?鄄鈣黏蛋白是與CIS復(fù)發(fā)、進展、無瘤生存率顯著相關(guān)的獨立因素，提示E?鄄鈣黏蛋白異常表達的腫瘤侵襲性高，需要早期徹底治療。Rao等分析細(xì)胞支架蛋白－肌動蛋白（Gelsolin）和E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義，結(jié)果示Gelsolin與膀胱癌進展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的顯著意義，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義還有待明確。
與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，深入研究此類標(biāo)記十分必要。目前對泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究雖已取得進展，但除了對個別標(biāo)記物Rb、Ki67的意見較為統(tǒng)一外，對絕大多數(shù)標(biāo)記物在腫瘤中的表達分布及預(yù)后價值仍存在爭議，目前的文獻報道多存在樣本量小的問題，缺少大規(guī)模研究的支持，再加上免疫組化法檢測蛋白受抗體選擇、陽性結(jié)果判斷、手工操作等外在因素影響的問題，導(dǎo)致研究結(jié)果之間缺乏可比性或?qū)ν愌芯繉ο蟮贸鱿喾吹慕Y(jié)論，因此需要將實驗方法標(biāo)準(zhǔn)化以提高研究的可靠性和可重復(fù)性。此外，由于腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移是涉及多種分子機制的極其復(fù)雜的過程，僅憑對單一預(yù)后指標(biāo)的評估不能全面準(zhǔn)確地反映腫瘤的惡性潛能，腫瘤免疫標(biāo)記物最終的臨床應(yīng)用可能是多個指標(biāo)的綜合評估。
參考文獻
[1] Migaldi M， Rossi G， Maiorana A， et al. Superficial papillary urothelial carcinomas in young and elderly patients: a comparative study[J]. BJU Int， 2004， 94(3): 311-316.
[2] Yeniyol CO， Suelozgen T， Vardar E， et al. The relation of mutant p53 accumulation in transitional cell carcinoma of bladder with pathological stage， grade， recurrence and survival[J]. Int Urol Nephrol， 2001， 33(3): 473-478.
[3] Ong TA， Peh SC， Goh KS， et al. P53 protein expression in transitional cell carcinoma of the bladder?鄄experience of the university of Malaya Medical Centre[J]. Asian J Surg， 2003， 26(1): 31-36.
[4] Sanchez Zalabardo D， Rosell Costa D， Fernandez Montero JM， et al. Prognostic value of p53， Ki67， and Rb protein in infiltrating bladder tumors[J]. Actas Urol Esp， 2002， 26(2): 98-103.
[5] Shariat SF， Kim J， Raptidis G， et al. Association of p53 and p21 expression with clinical outcome in patients with carcinoma in situ of the urinary bladder[J]. Urology， 2003， 61(6): 1140-1145.
[6] Chatterjee SJ， Datar R， Youssefzadeh D， et al. Combined effects of p53， p21， and pRb expression in the progression of bladder transitional cell carcinoma[J]. J Clin Oncol， 2004， 22(6):1007-1013.
[7] Liukkonen T， Lipponen P， Raitanen M， et al. Evaluation of p21WAF1/CIP1 and cyclin D1 expression in the progression of superficial bladder cancer[J]. Urol Res， 2000， 28(5): 285-292.
[8] Hitchings AW， Kumar M， Jordan S， et al. Prediction of progression in pTa and pT1 bladder carcinomas with p53， p16 and pRb[J]. Br J Cancer， 2004， 91(3): 552-557.
[9] Duggan B， Williamson K. Molecular markers for predicting recurrence， progression and outcomes of bladder cancer (do the poster boys need new posters?) [J]. Curr Opin Urol， 2004， 14(5): 277-286.
[10] Frank I， Cheville JC， Blute ML， et al. Prognostic value of p53 and MIB?鄄1 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder with regional lymph node involvement[J]. Cancer， 2004， 101(8): 1803-1808.
[11] Uchida T， Minei S， Gao JP， et al. Clinical significance of p53， MDM2 and bcl?鄄2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder[J]. Oncol Rep， 2002， 9(2): 253-259.
[12] Asci R， Yildiz L， Sarikaya S， et al. p53 and bcl?鄄2 overexpression as associated risk factors in patients 40 years old or less with transitional cell carcinoma of the bladder[J]. Urol Int， 2001， 67(1): 34-40.
[13] Mizutani Y， Yoshida O， Ukimura O， et al. Prognostic significance of a combination of soluble fas and soluble fas ligand in the serum of patients with Ta bladder cancer[J]. Cancer Biother Radiopharm， 2004， 17(5): 563-567.
[14] Theodoropoulos VE， Lazaris ACh， Sofras F， et al. Hypoxiainducible factor 1α expression correlates with angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer[J]. Eur Urol， 2004， 46(2):200-208.
[15] Kausch I， Bohle A. Molecular aspects of bladder cancer.Ⅲ. Prognostic markers of bladder cancer[J]. Eur Urol， 2002， 41(1): 15-29.
目的初步探討何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。方法MTT比色法檢測何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的促進作用；HE染色法觀察其流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果經(jīng)聚酰胺柱層析洗脫的何首烏流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有不同的作用，其中D流分隨著濃度的增加，對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進作用，顯微鏡下觀察到細(xì)胞的數(shù)量及分裂相增多，B和C流分對細(xì)胞的增殖影響不大，而A流分對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制生長作用，細(xì)胞的數(shù)量減少，核固縮。結(jié)論何首烏提取物聚酰胺柱層析流分中含有促人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的活性物質(zhì)。
【關(guān)鍵詞】 何首烏 聚酰胺柱色譜 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 MTT比色法 HE染色法
Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects on human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of the fractions isolated from Polygonum multiflorm Thunb extracted with polyamide column chromatography. MethodsThe activity of promoting HUVECs growth of each fraction was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stain. ResultsThe fractions eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs. With the increase of concentration，the fraction D could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly. The cells showed morphological change significantly under microscope. Compared with the control，the cell quantity and mitosis of the fraction D were increased. However， there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast， fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs ， which caused the decrease in the cell number and karyopycnosis. ConclusionThere are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from polygonum multiflorm Thunb.
Key words: Polygonum multiflorm Thunb.； Polyamide column chromatography； Human umbilical vein vascular endothelial cell(HUVEC)； MTT colorimetric assay； HE stain
何首烏Polygonum multiflorm Thunb.系蓼科植物何首烏的干燥塊根，具有烏須發(fā)、悅顏色、補肝腎、抗衰老之良效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒張血管、抗氧化等作用，且這些作用與其中的活性成分二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有關(guān)［1，2］。二苯乙烯苷又稱芪多酚，屬多羥基芪類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有清除自由基［2］、降低膽固醇［3］、保護肝臟等［4］作用。本實驗采用MTT法和HE染色法觀察何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，為何首烏的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 材料
聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm）購于浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；何首烏飲片購自廣西醫(yī)藥公司；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購自武漢大學(xué)保藏中心。
1.2 儀器
RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海博通)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；紫外線檢出器(日本)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma MODEL 3111)；Σ960酶標(biāo)儀；倒置相差熒光顯微鏡（Olympus CXZIFSZ）；生物顯微鏡（日本Olympus）。
1.3 試劑乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龍化工)；冰乙酸(上海實意化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(重慶川江化工)；氯仿(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)，以上試劑級別均為分析純。RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO Invitrogen cooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
自配試劑 ：2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀顯色劑；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；蘇木精染液；伊紅染液及1%稀鹽酸乙醇溶液。
2 方法
2.1 何首烏流分提取分離取2 kg何首烏粉用4倍量70%乙醇回流提取，濃縮后的總浸膏依次采用環(huán)己烷、醋酸乙酯、正丁醇分別進行萃取。采用聚酰胺柱層析法，以蒸餾水-乙醇為洗脫劑對正丁醇層浸膏進行分離，收集各流分；點樣，在365 nm處用紫外燈觀察，并以2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀顯色跟蹤檢測，合并相同流分，減壓濃縮。按洗脫順序分別得到A，B，C，D流分組。
2.2 活性研究
2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%熱滅活新生牛血清的培養(yǎng)液中，置二氧化碳培養(yǎng)箱，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。
2.2.2 MTT法測定細(xì)胞生長增殖實驗取指數(shù)生長期細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養(yǎng)液計數(shù)并稀釋至1×104個/ml。將稀釋的細(xì)胞懸液按100 μl/孔接種至96孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁后，選擇A，B，C，D 4種流分，每組設(shè)5個濃度梯度加入至96孔板中，每個濃度設(shè)3個平行孔。同時設(shè)PBS空白對照組6孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，取出孔板，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2條件下孵育4 h，棄盡孔內(nèi)液，每孔中加入200 μl的DMSO溶解MTT產(chǎn)物。振蕩30 s，用酶標(biāo)儀于490 nm處測定每個孔的吸光值A(chǔ)值。計算存活率：細(xì)胞存活率(%)=(用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%
2.2.3 HE染色法觀察流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響取貼壁生長的細(xì)胞，用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養(yǎng)液計數(shù)并稀釋至1×104個/ml。 將稀釋的細(xì)胞懸液按2 ml/孔接種至6孔板，加入已高壓滅菌的蓋玻片，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的流分，藥物組設(shè)定如下：A流分組、D流分組，每組設(shè)兩個濃度梯度，每個濃度設(shè)2個平行孔；同時設(shè)2孔空白對照組。培養(yǎng)24 h后，取出蓋玻片。用95％乙醇固定，蘇木精及伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，攝像。
3 結(jié)果
3.1 MTT實驗結(jié)果不同濃度的流分分別作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后，采用MTT法測定其對細(xì)胞生長的作用。其中流分D對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長具有促進作用，出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即濃度越高，存活率越高。流分A對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的抑制生長作用。流分B，C與對照組比較，基本無差異。結(jié)果見表1。
表1 何首烏提取物4種流分對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用(略)
3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變經(jīng)HE染色后顯微鏡觀察，可見正常的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞漿豐富，均勻，細(xì)胞核規(guī)則，呈紫藍色，核內(nèi)染色均一。A流分組對細(xì)胞具有抑制作用，光鏡下觀察到細(xì)胞的數(shù)量減少，部分細(xì)胞特別是高濃度組出現(xiàn)胞漿減少，核固縮現(xiàn)象。D流分組對細(xì)胞具有明顯的促進生長作用，尤其是高濃度組表現(xiàn)為細(xì)胞生長旺盛，核分裂相增多，細(xì)胞數(shù)量增多。見圖1。
4 討論
聚酰胺是通過己內(nèi)酰胺聚合而成的尼龍-6（錦綸、卡普隆）及由己二酸與己二胺聚合而成的尼龍-66，是一種白色多孔非晶型粉末，其分子中含有豐富的酰胺基，可與多酚類化合物的羥基（或羧基）形成分子間氫鍵而將其吸附。分子中酚羥基數(shù)目越多，芳香化程度越高的化合物與酰胺基的結(jié)合力越強，從而實現(xiàn)與其它物質(zhì)的分離［5］。結(jié)合本文MTT法結(jié)果可以知道，較晚洗脫出來的流分D，對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促進增殖生長作用，推測流分D中促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的物質(zhì)可能與含有酚羥基數(shù)目較多有關(guān)。但要確定酚羥基是否為促人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的藥效團有待進一步研究。
血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管張力和血流調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞還可以阻止血小板和白細(xì)胞的激活，所以完整的內(nèi)皮系統(tǒng)在維持血管穩(wěn)定和防止血栓方面發(fā)揮重要作用。臨床實踐證實中藥何首烏提取物對生物體多種代謝活性具有積極的影響作用。本實驗結(jié)果表明，在何首烏醇提物的正丁醇萃取物中含有對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生促進作用的活性物質(zhì)，可使細(xì)胞的分裂相增多，染色質(zhì)豐富，為進一步從何首烏中分離純化具有保護和修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性物質(zhì)提供了依據(jù)。
【參考文獻】
［1］李玉芳，何玄華.何首烏現(xiàn)代研究進展［J］.中成藥，1997，19(5):37.
［2］Ryu G，Ju JH，Park YJ，et al. The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum［J］.Arch Pharm Res，2002，25(5):636.
［3］Arichi H， Kimura Y， Okuda H，et al. Effects of stilbene components of the roots of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. on lipid metabolism［J］.Chem Pharm Bull (Tokyo). 1982 ，30(5):1766
【摘要】 為了了解凍存復(fù)蘇過程對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物學(xué)特性和支持造血能力的影響，采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)骨髓MSC，將傳代后的細(xì)胞用含10％二甲亞砜、40％胎牛血清的IMDM細(xì)胞凍存液保存在-196℃液氮中，觀察短期（4周）和中期（9-15月）復(fù)蘇后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同凍存前的MSC進行比較。 結(jié)果表明：中短期凍存后的MSC的細(xì)胞活性分別為(90士3.75)％和(93士2.51)％；凍存后細(xì)胞的增殖能力、免疫表型、體外分化為脂肪和骨細(xì)胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生長作用和凍存前MSC相似。結(jié)論：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，細(xì)胞活性略有下降，但是并不影響MSC的增殖、分化和支持造血能力。
【關(guān)鍵詞】 支持造血
Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal
Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation
Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)％ and (90士3.75)％ for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.
Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell； hematopoiesis support
間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且來源廣泛，容易在體外培養(yǎng)和擴增，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示了良好的治療效果［1-4］。將培養(yǎng)后的MSC凍存，在患者需要MSC治療時給予輸注，具有很好的臨床應(yīng)用前景。但是，凍存是否會影響MSC的生物學(xué)特征，我們尚不清楚。因此，本研究將骨髓來源的MSC凍存于-196℃液氮中，觀察中期和短期凍存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同凍存前的MSC進行比較，為進一步在臨床中的應(yīng)用提供詳盡的實驗依據(jù)。
材料和方法
試劑
IMDM、DMEM、DF12、MCDB培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清和甲基纖維素均為Gibco公司產(chǎn)品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3購自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式維甲酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）和二甲亞砜（DMSO）購自Sigma公司。
MSC的分離和培養(yǎng)
骨髓來自8例健康志愿者（年齡18-34歲，平均29歲）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077）400×g 離心20分鐘，取白環(huán)以上細(xì)胞部分，計數(shù)后接種于含40% MCDB、2% FCS的DF12培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達到70%融合時，常規(guī)消化傳代。
MSC的凍存和復(fù)蘇
將1×106細(xì)胞加入含10％ DMSO和40% FCS的IMDM中，總體積1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天轉(zhuǎn)入-196℃中凍存。將中期9-15個月（平均13個月）和短期（4周）凍存的MSC置于37℃水浴中快速復(fù)溫，凍融后加入8 ml IMDM混勻后離心，然后再用IMDM洗滌1次，置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，更換新鮮培養(yǎng)液。
細(xì)胞活性和增殖能力測定
應(yīng)用臺盼藍拒染回收率（TBR）試驗檢測復(fù)蘇細(xì)胞的活性，TBR(%)＝凍存后活細(xì)胞計數(shù)/凍存前活細(xì)胞計數(shù)×臺盼藍拒染率×100％。將凍存前后的MSC接種在24孔板中（5×103細(xì)胞/孔），置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天取2孔細(xì)胞進行計數(shù)，計算均值，繪制生長曲線。
細(xì)胞免疫表型分析
用含20 g/L BSA的PBS將胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的細(xì)胞懸液。每個上機試管中加入500 μl細(xì)胞懸液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR單克隆抗體，同時設(shè)空白對照，于4℃孵育30分鐘，PBS洗3遍。再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分鐘，PBS洗4遍，用流式細(xì)胞儀檢測。使用cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。
體外誘導(dǎo)多向分化檢測
成骨誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應(yīng)用von Kossa染色檢測鈣化小結(jié)。
脂肪誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，7天后油紅O染色檢測脂肪滴。
支持造血的能力測定
將凍存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ線照射，然后更換為長期培養(yǎng)液（含12.5％ FCS、 12.5%馬血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氫化考的松的IMDM）。獲取健康人骨髓單個核細(xì)胞，預(yù)先培養(yǎng)4小時以去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞按照1×106/ml接種在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每周半量換液。4周后獲取全部細(xì)胞接種于甲基纖維素體系中測定其集落形成能力。培養(yǎng)體系為: IMDM中含30%馬血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巰基乙醇、1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成實驗在24孔培養(yǎng)板中進行，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)14天。每孔接種1×106個細(xì)胞。14天后在倒置顯微鏡下計數(shù)集落，50個以上細(xì)胞為1個集落。
統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較應(yīng)用方差分析。
結(jié) 果
骨髓MSC的形態(tài)特征和生長特點
于倒置顯微鏡下，凍存前骨髓MSC為成纖維樣，胞漿豐富，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯，平行排列或旋渦樣生長。根據(jù)細(xì)胞生長曲線，骨髓MSC的倍增時間約為42.03士2.41小時。細(xì)胞形態(tài)和倍增時間隨著細(xì)胞傳代并不發(fā)生改變。
凍存后MSC的活性率和增殖能力
骨髓MSC的活性率（TBR）隨著凍存時間的延長略有下降。短期凍存MSC的TBR為93士2.51％；中期凍存MSC的TBR為90士3.75％。二者之間并沒有顯著性差異。凍存后MSC的增殖能力同凍存前相比較，沒有明顯差異。依據(jù)生長曲線可以得出短期和中期凍存后骨髓MSC的倍增時間分別為39.54士3.53小時和41.64士1.68小時。
凍存前后MSC的免疫表型
通過流式細(xì)胞儀檢測凍存前后骨髓MSC的免疫表型發(fā)現(xiàn)，凍存前后MSC均表達CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均為陰性(表1)。CD分子的表達量在凍存前后略有不同，但均不存在顯著性差異。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略）
多系分化的鑒定
成骨分化 2周后細(xì)胞聚集成集落，并有少量鈣鹽沉積，繼續(xù)培養(yǎng)1周，細(xì)胞呈現(xiàn)多層生長的結(jié)節(jié)狀，并有大量鈣鹽沉積，而對照組細(xì)胞仍為單層生長，無鈣鹽沉積。von Kossa 染色證實為鈣鹽沉積(圖A)，對照組無上述現(xiàn)象出現(xiàn)。
成脂肪分化 3-5天后發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞中有小脂肪滴出現(xiàn)，繼續(xù)誘導(dǎo)，1周后可以看見大部分細(xì)胞胞體變大，胞漿出現(xiàn)大量脂肪滴，油紅O染色證實為脂肪滴(圖B)，而對照組細(xì)胞胞漿中無脂肪滴出現(xiàn)，油紅O染色為陰性。
凍存后的MSC同樣具有成骨和成脂肪分化能力(圖C，D)。
支持造血作用
為了評估凍存是否影響MSC支持造血的能力，將骨髓單個核細(xì)胞接種于照射過的凍存前和復(fù)蘇的MSC中，在長期骨髓培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周后檢測CFU生成情況。如表2所示，凍存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的產(chǎn)率在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC為滋養(yǎng)層的骨髓長期培養(yǎng)體系中并無顯著性差異。Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略）
討 論
MSC是造血微環(huán)境中主要組成部分，通過合成、分泌多種造血因子和黏附分子來調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖、分化和自我更新。既往研究顯示，MSC可以合成并分泌多種造血細(xì)胞生長因子，具有維持長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的能力，促進造血干細(xì)胞的增殖和分化［5］。聯(lián)合MSC的移植方案還可以促進HSC的植入和移植后的造血恢復(fù)［6］。但是，在體外培養(yǎng)擴增中，MSC的增殖能力會逐漸下降并發(fā)生分化，支持造血的能力減弱。將擴增后或者增殖旺盛的MSC進行凍存，在需要的時候復(fù)蘇培養(yǎng)，可以有效地解放上述問題并確保提供足夠的MSC應(yīng)用于臨床。
既往的大量研究顯示，造血干細(xì)胞可以在液氮中長期凍存，復(fù)蘇后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC經(jīng)過低溫凍存和復(fù)蘇，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影響，尚不明確。因此，我們觀察了骨髓MSC經(jīng)過短期（4周）和中期（9-15月）凍存后的生物學(xué)特性和支持造血能力。結(jié)果顯示，經(jīng)過中期和短期凍存后MSC的形態(tài)并未發(fā)生改變，仍為梭形，貼附在培養(yǎng)瓶底。凍存后MSC的活性略有下降，但凍存并不影響細(xì)胞的增殖能力，凍存前和中期、短期凍存后MSC的倍增時間在40小時左右，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析不具有顯著性差異。通過FACS檢測，凍存前后的MSC的免疫表型沒有明顯改變，表現(xiàn)為CD29、CD44和CD105為陽性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR為陰性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我們將經(jīng)過中期和短期凍存后MSC誘導(dǎo)向脂肪和骨分化，結(jié)果顯示凍存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且這種分化能力，并不隨著復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代而發(fā)生變化。由此可見，中期和短期凍存并不影響MSC的生物學(xué)特性。
支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，凍存后MSC支持造血能力是否發(fā)生變化將直接影響MSC的臨床應(yīng)用。Majumdar等［7］的研究顯示，骨髓MSC可以分泌多種造血生長因子，具有支持造血作用，能促進骨髓來源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是凍存后MSC支持造血能力如何變化，既往并無報道。在本實驗中，我們通過檢測體外長期培養(yǎng)體系中集落形成情況來評估凍存后MSC對造血干細(xì)胞的支持作用。骨髓單個核細(xì)胞在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC作為滋養(yǎng)層的骨髓長期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，4周后的骨髓單個核細(xì)胞的CFU生成率在各體系之間沒有顯著性差別。這說明經(jīng)過中期和短期凍存后MSC仍具有支持造血能力，同凍存前比較，支持造血能力沒有明顯變化。進一步分析上述不同培養(yǎng)體系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情況，結(jié)果表明：凍存前后MSC均可以促進CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促進定向祖細(xì)胞的增殖能力在凍存前后沒有明顯差別。這些結(jié)果表明，凍存并不影響MSC促進不同階段造血祖細(xì)胞增殖、分化的能力。
綜上所述，本研究通過體外實驗初步證實：經(jīng)過中期和短期低溫凍存的骨髓MSC并不改變其固有的生物學(xué)特性。雖然凍存可以導(dǎo)致部分細(xì)胞損傷，但是并不影響剩余細(xì)胞的增殖能力和多向分化能力。此外，凍存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，凍存后MSC是否在體內(nèi)仍具有上述生物學(xué)性狀和支持造血功能，尚需進一步研究證實。
【參考文獻】
1Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature，2002; 418（6893）: 41-49
2Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell，2001; 105: 369-377
3Noort WA，Kruisselbrink AB，in’t-Anker PS，et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol，2002; 30: 870-878
4Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapid hematopoietic reco-very after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy.J Clin Oncol，2000; 18: 307-316
5Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.J Cell Physiol，1998; 176:57-66
[關(guān)鍵詞]血管;組織工程;細(xì)胞外基質(zhì);生物力學(xué)
[中圖分類號]R318[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)07-0996-04
Effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical properties of the canine carotid artery
LIU Guo-feng1,HE Zhi-juan2,YANG Da-ping1,XU Xue-wu1,LIU Ying1,REN Li-hong1,LI Qing-chun1
(1.Department of Plastic Surgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 15001 0,Heilongjiang,China)
Abstract:ObjectiveThe objective of this study is to investigate the effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical and structural properties of the canine carotid artery.MethodsIntact canine carotid artery were decellularized by using Trypsin/EDTA,ribonuclease and desoxyribonuclease. Residual cellular and extracellular matrix composition was evaluated with hematoxylin and eosin (H&E) staining,quantitative DNA analysis and scanning electron microscopy. Tensile strength, burst strength and compliance were measured in vitro to determine the effects of decellularizedprocess on the biomechanical properties of the canine carotid artery.ResultsHistology and scanning electron microscopy examination demonstrate that scaffolds were completely decellularized and scaffolds revealed a well-preserved extracellular matrix. Compared with fresh canine carotid artery, decellularized artery had similar burst and breaking strength and had lower compliance.Conclusion This study demonstrates that the decellularized artery using biotic enzymes had similar burst and breaking strength and had lower compliance compared with fresh canine carotid artery.
Key words: vascular grafts; tissue engineering; extracellular matrix; biomechanical
血管組織工程學(xué)研究為臨床上小口徑血管移植物的制備提供了光明的前景,口徑小于6mm的小口徑組織工程血管研究與大口徑血管移植物的研究有很大的差別[1]。因為血管移植物與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)的匹配程度對不同口徑的組織工程血管移植物通暢率的影響差別較大,血管移植物的口徑越小受到的影響越大,小口徑血管移植物在受體內(nèi)更容易發(fā)生內(nèi)膜增生、中膜增厚,最后導(dǎo)致移植物的官腔狹窄甚至閉塞[2]。血管組織工程研究中支架材料的力學(xué)性質(zhì)對血管移植物的生物力學(xué)性質(zhì)起著決定性的作用,所以在小口徑組織工程工程血管的研究中制備與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)完全匹配的支架材料是最關(guān)鍵的科學(xué)問題,這將決定小口徑組織工程血管移植的遠(yuǎn)期通暢率[3]。本實驗將對小口徑組織工程血管脫細(xì)胞基質(zhì)生物支架材料的生物力學(xué)性質(zhì)進行研究,明確生物酶聯(lián)合消化法對犬頸總動脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料生物力學(xué)的影響。
1材料和方法
1.1 實驗用動物:普通雜種家犬,體重25～30kg,6個月齡,雌雄不限。
1.2 實驗材料及主要儀器:胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)、脫氧核糖核酸酶(Desoxyribonu clease,DNase):美國Sigma公司;EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer solution,PBS):北京中杉生物公司;普通光學(xué)顯微鏡:日本Nikon公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡:日本Hitachi公司;電子萬能實驗材料機:德國Zwick-Roell公司。
1.3 犬頸總動脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料制備: 無菌條件下切取犬頸總動脈,大量無菌PBS沖洗,去除血液成分及外層附屬軟組織,選擇切取長度約為7cm,內(nèi)徑約為3mm的動脈,利用胰蛋白酶和核酸酶連續(xù)消化法去除動脈細(xì)胞及其碎片成分[4]。先用0.1% 胰蛋白酶加0.02% EDTA 溶液消化20h,中間更換1次消化液,大量PBS沖洗后用20μg/ml RNase +200μg/ml DNase溶液消化2h,大量無菌PBS 溶液沖洗。以上步驟均在5%CO2、37℃,80次/ min持續(xù)震蕩條件下進行。監(jiān)測制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì),使材料的細(xì)胞DNA殘留量少于0.1%。同時選取新鮮犬頸總動脈作為對照組(每組6例),進行以下檢測。
1.3 組織學(xué)染色 將標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液中固定24h,常規(guī)石蠟包埋、切片,進行HE染色。在普通光學(xué)顯微鏡下對標(biāo)本的結(jié)構(gòu)進行組織學(xué)評價照相。
1.4 掃描電鏡觀察 將標(biāo)本在1%戊二醛溶液中固定24h以上,用1%餓酸作后固定2h,50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水,50%、70%、90%、100%醋酸異戊酷置換,應(yīng)用臨界點干燥儀、液體C02等進行干燥;干燥的標(biāo)本固定在鋁質(zhì)標(biāo)本臺上,用濺射鍍膜機鍍金后,用S-3400N型掃描電子顯微鏡系統(tǒng)觀察并照相。
1.5 生物力學(xué)檢測:利用Zwick/Roell Z010型電子萬能力學(xué)實驗機測定標(biāo)本的拉伸強度、爆裂強度及軸向順應(yīng)性。拉伸強度及軸向順應(yīng)性檢測:將管狀標(biāo)本(長度為5cm)兩端固定于微型夾具上,以0.5mm/s的速度拉伸,直至標(biāo)本斷裂,系統(tǒng)自動記錄標(biāo)本的應(yīng)力-應(yīng)變曲線及極限拉伸強度,計算出標(biāo)本的軸向順應(yīng)性。爆裂強度檢測:把管狀標(biāo)本一端用絲線結(jié)扎,另一端固定于裝滿生理鹽水的5ml醫(yī)用注射器上,注射器筒壁固定于250ml玻璃葡萄糖瓶中,整個裝置平置在力學(xué)實驗機上,以40kPa/s的力向標(biāo)本內(nèi)注射生理鹽水,直至標(biāo)本爆裂或漏液,系統(tǒng)自動記錄標(biāo)本的爆裂強度。
1.6統(tǒng)計學(xué)分析: 所有定量實驗結(jié)果均用x±s表示,利用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟行獨立樣本t檢驗,P
2結(jié)果
2.1大體所見:犬頸總動脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料仍保持新鮮血管的管狀結(jié)構(gòu),血管的長度及內(nèi)徑無明顯改變,材料外觀呈乳白色(圖1)。
2.2 組織學(xué)結(jié)構(gòu):新鮮犬頸總動脈具有血管典型的三層結(jié)構(gòu):內(nèi)膜、中膜及外膜,中膜層較厚,包含大量的環(huán)狀排列藍染的細(xì)胞核成分和細(xì)胞外基質(zhì)成分(圖2A)。經(jīng)脫細(xì)胞處理后,血管壁中的藍染的細(xì)胞核成分全部去除,但脫細(xì)胞血管的細(xì)胞外基質(zhì)中纖維成分保存完整連續(xù),沒有發(fā)生斷裂破碎等。血管的中膜層結(jié)構(gòu)中可見細(xì)胞及部分細(xì)胞外基質(zhì)去除后遺留的空隙,同時血管內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)成分保持完好(圖2B)。
2.3 掃描電鏡觀察:脫細(xì)胞犬頸總動脈脫細(xì)胞基質(zhì)橫斷面的掃描電鏡照片可見大致的三層細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu),內(nèi)層見完整致密的內(nèi)彈性膜,中層可見成層環(huán)狀排列的纖維板層結(jié)構(gòu),纖維連續(xù),可見梭形空隙,材料外層可見雜亂排列的外膜層纖維條索組織(圖3A)。材料內(nèi)表面掃描電鏡照片顯示,材料的內(nèi)彈性膜纖細(xì)的纖維呈網(wǎng)狀分布,纖維完整,未見明顯斷裂缺失,透過纖維網(wǎng)可見深部中膜層較粗大的纖維(圖3B)。
2.4 生物力學(xué)性質(zhì):爆裂強度檢測結(jié)果如下,脫細(xì)胞犬頸總動脈基質(zhì)組為315.00±12.49 KPa,新鮮犬頸總動脈組為330.52±18.73 KPa,兩組標(biāo)本爆裂強度相似,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。極限拉伸強度檢測結(jié)果如下:脫細(xì)胞犬頸總動脈基質(zhì)組為4 122.91±118.05 KPa,新鮮犬頸總動脈組為4 212.99±103.80 KPa,兩組標(biāo)本極限拉伸強度相似,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。軸向順應(yīng)性計算結(jié)果如下,脫細(xì)胞犬頸總動脈基質(zhì)組為0.945±0.158 mm/mm,新鮮犬頸總動脈組為1.195±0.22 mm/mm,脫細(xì)胞犬頸總動脈基質(zhì)組軸向順應(yīng)性低于新鮮犬頸總動脈組,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P
3討論
具有三維空間結(jié)構(gòu)的支架材料是構(gòu)建組織工程血管的基本要素之一,能為血管種子細(xì)胞生長和組織發(fā)育提供臨時的支撐骨架,并能夠調(diào)控所構(gòu)建血管的形態(tài)。研制和開發(fā)理想的支架材料仍然是血管組織工程所面臨的巨大挑戰(zhàn)。為了克服可降解高分子聚合物材料在生物相容性方面的不足,很多學(xué)者把研究目光轉(zhuǎn)移到了自然來源的生物支架材料上[5]。自然生物材料具有良好的生物相容性,能夠促進細(xì)胞的黏附、生長、增殖及生物功能的發(fā)揮。血管組織工程支架材料的發(fā)展趨勢是自然生物材料的應(yīng)用,自然生物材料是最有應(yīng)用潛力的組織工程支架材料來源[6]。血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料的三維空間結(jié)構(gòu)與自然血管的結(jié)構(gòu)非常類似,因此具有理想的外形和適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)性質(zhì),是血管組織工程學(xué)研究中較為理想的生物支架材料[7]。
正常血管的細(xì)胞外基質(zhì)成分包含膠原纖維、彈性蛋白及蛋白聚糖等成分,膠原纖維及彈性蛋白對于血管的強度起關(guān)鍵性的作用。膠原纖維具有良好的抗張強度,對于維持血管的完整性具有重要意義,彈性蛋白和蛋白聚糖有一定的彈性,能夠使血管具有良好的順應(yīng)性[8]。研究表明,脫細(xì)胞處理會改變血管原有的生物力學(xué)性質(zhì),特別是材料的順應(yīng)性常會降低[9]。本實驗利用生物酶連續(xù)消化法制備的犬頸總動脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料在去除了細(xì)胞及DNA殘留物的同時,細(xì)胞外基質(zhì)的纖維成分保持完整連續(xù),所以脫細(xì)胞材料的拉伸強度和爆裂強度與新鮮血管相似。除膠原纖維和彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)纖維成分外,蛋白聚糖成分在脫細(xì)胞處理過程中常會遭到破壞,蛋白聚糖的去除對于脫細(xì)胞血管的拉伸強度和爆裂強度沒有明顯的影響,但會使材料的彈性降低變硬,生物力學(xué)的表現(xiàn)是材料的順應(yīng)性下降[10]。本實驗的結(jié)果也證實了這一點,經(jīng)過生物酶連續(xù)消化脫細(xì)胞處理,脫細(xì)胞犬頸總動脈基質(zhì)材料的軸向順應(yīng)性有所降低,從組織學(xué)觀察可以看出,脫細(xì)胞后血管橫斷面膠原纖維和彈性蛋白等纖維條索中間出現(xiàn)很多梭形空隙,這些空隙是由于中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞及蛋白聚糖的去除而形成的,因此,脫細(xì)胞犬頸總動脈的軸向順應(yīng)性與新鮮血管相比有所降低。
組織工程血管的拉伸強度、爆裂強度的順應(yīng)性是重要的生物力學(xué)力學(xué)評價指標(biāo),足夠的拉伸強度和爆裂強度能夠保證血管移植后能夠抵抗長期的血液動力學(xué)作用而不形成動脈瘤。而對于小口徑組織工程血管移植物,順應(yīng)性與拉伸強度和爆裂強度相比顯得更為重要,小口徑血管移植物和受區(qū)血管之間的順應(yīng)性要匹配,這是移植物長期成功的重要保證[11-12]。血管移植物與受區(qū)血管之間的順應(yīng)性等力學(xué)性質(zhì)錯配會導(dǎo)致血流動力學(xué)的變化,血流方向改變、剪切力增加、下游血流紊亂、循環(huán)張力改變,從而引起吻合口處的應(yīng)力集中,刺激內(nèi)膜增生的生長因子的釋放增加,促進了血栓的形成和新內(nèi)膜的增生,最終導(dǎo)致血管移植物長期通暢率明顯降低[13-14]。脫細(xì)胞處理經(jīng)常會導(dǎo)致血管細(xì)胞外基質(zhì)材料順應(yīng)性的降低,從而影響構(gòu)建的小口徑組織工程血管與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)的匹配,導(dǎo)致移植失敗,所以提高以脫細(xì)胞血管基質(zhì)為支架材料的小口徑組織工程血管的順應(yīng)性是組織工程血管研究的瓶頸問題?？赡艿慕鉀Q方案包括:(1)改進完善脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的制備方法,在保證血管細(xì)胞成分完全去除的前提下盡量保留細(xì)胞外基質(zhì)材料原有的生物力學(xué)性質(zhì);(2)通過在脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料上復(fù)合某種其他材料制備順應(yīng)性良好的復(fù)合支架材料;(3)在體外利用脫細(xì)胞血管支架材料構(gòu)建組織工程血管的過程中促使平滑肌細(xì)胞分泌大量新生細(xì)胞外基質(zhì)成分,以增加組織工程血管的順應(yīng)性。
[參考文獻]
[1]Isenberg BC,Williams C,Tranquillo RT.Small-diameter artificial arteries engineered in vitro[J]. Circ Res,2006,98(1):25-35.
[2]Wang X,Lin P,Yao Q,et al. Development of small-diameter vascular grafts[J]. World J Surg,2007,31(4):682-689.
[3]Tiwari A,Cheng KS,Salacinski H,et al. Improving the patency of vascular bypass grafts: the role of suture materials and surgical techniques on reducing anastomotic compliance mismatch[J]. Eur J Vasc Endovasc Surg,2003,25(4):287-295.
[4]劉國鋒,楊大平,郭鐵芳,等. 小口徑組織工程血管脫細(xì)胞生物支架材料的研究[J]. 中國康復(fù)理論與實踐,2008,14(3): 234-236,301.
[5]Stegemann JP,Kaszuba SN,Rowe SL. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials[J]. Tissue Eng,2007,13(11):2601-2613.
[6]Meredith JE Jr,Fazeli B,Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor[J]. Mol Biol Cell,1993,4(9): 953-961.
[7]Schmidt CE,Baier JM. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J]. Biomaterials,2000,21(22):2215-2231.
[8]MacNeill BD,Pomerantseva I,Lowe HC,et al. Toward a new blood vessel[J]. Vasc Med,2002,7(3):241-246.
[9]Amiel GE, Komura M,Shapira O,et al. Engineering of blood vessels from acellular collagen matrices coated with human endothelial cells[J]. Tissue Eng,2006,12(8):2355-2365.
[10]Courtman DW, Pereira CA, Kashef V. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction[J]. J Biomed Mater Res,1994,28:655-666.
[11]Ballyk PD, Walsh C, Butany J,et al. Compliance mismatch may promote graft-artery intimal hyperplasia by altering suture-line stresses[J]. J Biomech, 1998,31(3):229-237.
[12]Abbott WM, Megerman J,Hasson JE,et al. Effect of compliance mismatch on vascular graft patency[J]. J Vasc Surg,1987,5(2):376-382.
[13]Howard AB,Alexander RW,Nerem RM,et al. Cyclic strain induces an oxidative stress in endothelial cells[J]. Am J Physiol,1997,272(2 Pt 1):C421-427.
一、精選教材
教材是課程知識內(nèi)容的載體，是進行教學(xué)活動的基本材料之一[2，3]。如何選擇和使用教材對教學(xué)任務(wù)的實施、完成和對教學(xué)質(zhì)量的影響至關(guān)重要。通過對相關(guān)院校的走訪、大量資料的查閱以及結(jié)合本校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)科的專業(yè)特點、課程學(xué)時數(shù)以及授課對象，最終確定以翟中和等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》為教學(xué)用教材，并及時跟進該書的新版本。在應(yīng)用該教材的同時，特別注重其他教科書的參考和補充，如將王金發(fā)編著的《細(xì)胞生物學(xué)》、王堃仁等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》、鄭國锠等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》、Alberts主編的《Molecular Biology of the Cell》等作為本課程的參考教科書。此外，教師在備課過程中還注重尋求教科書之外的教學(xué)資源，如國內(nèi)外重要學(xué)術(shù)期刊、國內(nèi)外知名大學(xué)《細(xì)胞生物學(xué)》課程網(wǎng)站，特別是國外互聯(lián)網(wǎng)站上與細(xì)胞生物學(xué)知識相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)資源。教學(xué)中將教材、參考教科書以及教科書之外的教學(xué)資源相互補充和凝練，力求教學(xué)內(nèi)容的系統(tǒng)性和前瞻性。
二、教學(xué)內(nèi)容的遴選
《生物化學(xué)》、《遺傳學(xué)》、《細(xì)胞生物學(xué)》和《生理學(xué)》等是水產(chǎn)學(xué)院重要的學(xué)科基礎(chǔ)課。這些課程在內(nèi)容上聯(lián)系極為密切，相互交叉和滲透。在《細(xì)胞生物學(xué)》課程的教學(xué)中，既要避免本課程與其他課程內(nèi)容的過度重復(fù)又要保證授課內(nèi)容的完整性、體現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)的核心內(nèi)容。根據(jù)水產(chǎn)學(xué)院的教學(xué)安排以及授課學(xué)生的實際情況，在《細(xì)胞生物學(xué)》理論課教學(xué)中對所用教材的內(nèi)容進行遴選，合理取舍與合并，最終形成十章作為本校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)科《細(xì)胞生物學(xué)》理論課教學(xué)內(nèi)容，即：“緒論”、“細(xì)胞的基本知識”、“細(xì)胞生物學(xué)的主要研究方法”、“細(xì)胞表面”、“細(xì)胞基質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)”、“線粒體”、“細(xì)胞骨架”、“細(xì)胞核與染色體”、“細(xì)胞周期和細(xì)胞的分裂與分化”和“細(xì)胞的衰老與凋亡”?！都?xì)胞生物學(xué)》理論課的教學(xué)內(nèi)容遴選后，授課中以細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能為主線，從顯微、亞顯微和分子水平闡述細(xì)胞結(jié)構(gòu)，特別是結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性，認(rèn)識細(xì)胞重要生命活動的基本內(nèi)容和本質(zhì)，掌握細(xì)胞生物學(xué)的基本概念和基礎(chǔ)理論，在《生物化學(xué)》、《遺傳學(xué)》和《生理學(xué)》課程學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)之上，通過《細(xì)胞生物學(xué)》的教學(xué)，使學(xué)生的知識體系更加系統(tǒng)化、深入化。
三、調(diào)整與優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容，因材施教，提高教學(xué)效果
由于課堂教學(xué)仍然是在校學(xué)生獲取知識的主要形式[4]，因此教學(xué)內(nèi)容確定后，教師要梳理每一章的教學(xué)內(nèi)容，清晰講授的重點和應(yīng)達到的具體教學(xué)目的。首先，教師要意識到第一次課的重要性，它對激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣有著重要的作用。與其他課程一樣，課程的講授內(nèi)容通常以緒論開篇。但是，不僅許多學(xué)生不重視緒論的內(nèi)容，教師也容易出現(xiàn)缺乏對緒論講授的激情[5]。教學(xué)中我們將教材[1]中緒論的內(nèi)容重排、調(diào)整與優(yōu)化，收到了較好的教學(xué)效果。授課中將細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展簡史作為最先講授的內(nèi)容，并結(jié)合一些與之相關(guān)的逸聞趣事，激發(fā)學(xué)生對該門課程學(xué)習(xí)的興趣，使學(xué)生在輕松的氛圍中了解學(xué)科的誕生、認(rèn)識學(xué)科的發(fā)展與實驗儀器和技術(shù)進步的關(guān)系；通過介紹“細(xì)胞學(xué)說”的建立，不僅使學(xué)生掌握了該學(xué)說的基本原理，還使學(xué)生意識到善于點滴積累以及歸納和總結(jié)對學(xué)習(xí)和工作的重要性，通過上述學(xué)習(xí)學(xué)生們也弄清了細(xì)胞生物學(xué)最基本的研究內(nèi)容。之后再介紹當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)的主要研究內(nèi)容和研究熱點，并將教材目錄與緒論的內(nèi)容相聯(lián)系，這樣不僅使細(xì)胞生物學(xué)的研究內(nèi)容深記于學(xué)生的腦海中，也便于他們對本課程后續(xù)內(nèi)容的學(xué)習(xí)和提高學(xué)習(xí)的信心。其次，授課內(nèi)容的順序編排要便于學(xué)生與已掌握的有關(guān)知識相銜接。根據(jù)授課對象的實際情況，教學(xué)中按著細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)，即：細(xì)胞表面→細(xì)胞質(zhì)→細(xì)胞核的順序，并將結(jié)構(gòu)或功能上聯(lián)系極為密切的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的知識放在一起講授。以本課程的“細(xì)胞表面”與“細(xì)胞基質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)”兩章為例，對教材以及相關(guān)的教科書中的有關(guān)內(nèi)容做了較大的調(diào)整，重新編排與優(yōu)化。授課時“細(xì)胞表面”一章，首先介紹細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)組成（質(zhì)膜、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外被、細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)細(xì)胞連接），各結(jié)構(gòu)的特點、功能以及這些結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系；通過這樣的講授使學(xué)生清楚地知道多細(xì)胞生物中雖然所有的細(xì)胞都具有“質(zhì)膜”這樣一個界膜，它是細(xì)胞表面核心結(jié)構(gòu)，但多細(xì)胞生物不僅由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞外還有細(xì)胞外基質(zhì)，同時沒有一個細(xì)胞是孤立的，細(xì)胞與細(xì)胞或與細(xì)胞外基質(zhì)形成特定的組織連接結(jié)構(gòu)，從而使多細(xì)胞生物成為一個和諧的統(tǒng)一體。之后再詳盡地介紹細(xì)胞表面核心結(jié)構(gòu)——質(zhì)膜的物質(zhì)的運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，通過這部分的學(xué)習(xí)又使學(xué)生對膜的不對稱性和流動性有了更好的理解。此外，由于核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在功能上的關(guān)系極為密切，因此將核糖體并入內(nèi)膜系統(tǒng)中介紹，形成本課程的“細(xì)胞基質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)”一章。授課中首先講解非膜性細(xì)胞器——核糖體在細(xì)胞中的分布、化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)以及功能，之后介紹內(nèi)膜系統(tǒng)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體的超微結(jié)構(gòu)與功能，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的蛋白質(zhì)加工功能與蛋白質(zhì)的分揀形成本章獨立的一節(jié)，即“蛋白質(zhì)的分揀與加工”，內(nèi)容包含信號假說、蛋白質(zhì)的修飾與加工、蛋白質(zhì)的分揀和膜泡運輸，此節(jié)為本章的教學(xué)重點之一。介紹信號假說時，由于有了核糖體的知識基礎(chǔ)，再結(jié)合具體的研究成果，學(xué)生則很容易理解分泌性蛋白的合成在細(xì)胞基質(zhì)中起始、肽鏈延伸暫停、向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移等信號假說的具體內(nèi)容；通過本節(jié)其他知識內(nèi)容的學(xué)習(xí)，清晰了蛋白質(zhì)的修飾加工可發(fā)生在肽鏈的合成以及運輸過程中，因此構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成、加工與運輸?shù)耐暾w系。此外，將溶酶體的發(fā)生也獨立成節(jié)，放在“蛋白質(zhì)的加工與分揀”一節(jié)之后，以溶酶體酶的M6P分揀途徑為例，將信號假說、蛋白質(zhì)的加工與分揀以及膜泡運輸?shù)牟糠謨?nèi)容串聯(lián)起來。通過上述講授內(nèi)容的遴選、調(diào)整與優(yōu)化，也使學(xué)生對結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)生上相互關(guān)聯(lián)的內(nèi)膜系統(tǒng)的理解更加透徹。再次，根據(jù)教學(xué)時數(shù)適當(dāng)安排自學(xué)與課后討論的教學(xué)內(nèi)容，培養(yǎng)學(xué)生自主和探究學(xué)習(xí)的能力。如“細(xì)胞生物學(xué)的主要研究方法”一章，不可能在有限的學(xué)時內(nèi)將該部分內(nèi)容講透徹，因此該部分內(nèi)容以學(xué)生自學(xué)、課下參觀相關(guān)的儀器設(shè)備及與教師交流討論的形式實現(xiàn)學(xué)生對該部分知識的獲取；此外根據(jù)授課專業(yè)特點，葉綠體的知識也以學(xué)生自學(xué)和課下與老師交流的方式進行。最后，注重講授內(nèi)容與其他課程內(nèi)容上既不過度重復(fù)又要較好地銜接。如在講授質(zhì)膜的功能——鈉鉀泵的知識時注意與《生理學(xué)》膜電位的知識相聯(lián)系、細(xì)胞骨架中微絲的功能時注重與《生理學(xué)》以及《組織胚胎學(xué)》肌肉收縮內(nèi)容的銜接，線粒體功能的講解則考慮與《生物化學(xué)》的內(nèi)容不過度重復(fù)和較好的銜接，而細(xì)胞核與染色體的知識需要考慮學(xué)生在《遺傳學(xué)》課程上已掌握的知識。由于本課程的開設(shè)在上述幾門課程之后，這就要求我們與上述課程的任課教師以及授課學(xué)生良好的溝通，適當(dāng)調(diào)整本課程的授課內(nèi)容與重點，從而使學(xué)生通過《細(xì)胞生物學(xué)》課程的學(xué)習(xí)，使他們知識體系更加系統(tǒng)化、深入化。
由于細(xì)胞生物學(xué)的知識面廣、信息量大、發(fā)展快，因此教學(xué)內(nèi)容的改革是教學(xué)改革最重要的部分。結(jié)合我校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)科的專業(yè)特點和授課對象的實際情況，對《細(xì)胞生物學(xué)》理論課的教學(xué)內(nèi)容進行遴選、調(diào)整重排與優(yōu)化，并且應(yīng)用于《細(xì)胞生物學(xué)》的教學(xué)中，提高了教學(xué)效果。此外，通過多年的教學(xué)實踐我們深深地體會到，完成好教學(xué)內(nèi)容，教師尤其要注重自身知識理論水平的提高，不斷地豐富教學(xué)內(nèi)容，才能不斷提高教學(xué)效果與教學(xué)質(zhì)量。
參考文獻：
[1]張晶，華子春.細(xì)胞生物學(xué)課程體系優(yōu)化的實踐與思考[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2011，33（6）：716-719.
