發(fā)布時(shí)間：2024-03-06 14:44:43
序言：寫作是分享個(gè)人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的發(fā)育生物學(xué)的研究進(jìn)展樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
【關(guān)鍵詞】性別控制，畜牧業(yè)，性別決定，發(fā)展前景
性別控制一直是生命科學(xué)的重要研究課題之一，性別控制技術(shù)是指通過對(duì)動(dòng)物的正常生殖過程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門現(xiàn)代生物技術(shù)，是一項(xiàng)能顯著提高家畜繁殖效率的生物工程技術(shù)，對(duì)家畜育種，生產(chǎn)和遺傳疾病的繁殖都有很重要的意義。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中許多性狀受到性別因素的制約，性別控制技術(shù)對(duì)于我國現(xiàn)有生產(chǎn)條件不變而奶制品和肉制品需求迅速增加的現(xiàn)狀來說，更意味著生產(chǎn)資料的高效利用和畜牧業(yè)生產(chǎn)效率的提高。
1性別決定原理
哺乳動(dòng)物性別分化之前，僅有位于中腎內(nèi)緣的性腺原基，這種未分化的性腺中胚層處于中性。胚胎是含有牟勒氏管、吳夫氏管兩套生殖導(dǎo)管和未分化性腺的中性胚，性腺原基分化的類型決定了機(jī)體將來性別的發(fā)育（張紅衛(wèi)等，2001）。當(dāng)性腺原基被決定因子（SRY）誘導(dǎo)發(fā)育成，支持細(xì)胞則會(huì)分泌抗牟勒氏管因子而使牟勒氏管解體，這時(shí)吳夫氏管發(fā)育為雄性生殖管道。當(dāng)性腺原基發(fā)育為卵巢，由卵巢分泌的雌激素則使牟勒氏管發(fā)育為陰道、子宮和輸卵管等（朱必才等，2002）。目前發(fā)現(xiàn)， 性別決定過程中有三種基因調(diào)控未分化性腺的發(fā)育及雄性性別決定，分別是WT-1、SF-1和SOX9。
2性別控制方法
目前研究性別控制的途徑和方法主要集中在受精前X、Y的分離，受精后的胚胎性別鑒定和控制。
2.1 X與Y的分離
精母細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂后產(chǎn)生X、Y兩種不同類型的，如果X和卵子結(jié)合則產(chǎn)生雌性后代，若Y和卵子結(jié)合則產(chǎn)生雄性后代。分離動(dòng)物中X和Y， 是解決家畜性別控制的關(guān)鍵問題。
X和Y的差異主要表現(xiàn)在：形態(tài)上，X 頭部比較大， DNA含量多；在重量和比重上，X重，比重大且表面膜電荷多；在運(yùn)動(dòng)性和活力方面，Y活動(dòng)能力較強(qiáng)， 速度快；耐酸堿性方面，Y 嗜堿不耐酸；并且YF一小體陽性（朱曉華等，2001）。
目前分離X和Y的方法主要有：沉積分離法、梯度離心法、電泳法、白蛋白沉淀法、免疫法、流式細(xì)胞儀分類法。
沉積分離法主要是利用X沉積速率比Y快的原理來分離，但是這種方法由于缺乏重復(fù)性和其它動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證實(shí)而為廣泛采用（張光勤和李建民，2002）。梯度離心法是根據(jù)X染色體的體積比Y染色體的大，且比重不同等特點(diǎn)來分離的，但是該方法只能做到大部分分離，因此性別控制也只能達(dá)到70～80%（巖崎說雄等，1987；張光勤和李建民，2002）。電泳法主要是根據(jù)X、Y所帶的生物電不同而設(shè)計(jì)的一種分離方法，以中型緩沖液電泳時(shí)向陽離子移動(dòng)的X比Y多來對(duì)進(jìn)行分離，但是分離結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性都不理想，并且在電泳液中不易存活，分選后的活力低，因此難以推廣（張淑娟，2005；George et al.， 2002）。
白蛋白沉淀法是依據(jù)Y在白蛋白溶液中的運(yùn)動(dòng)速度比X的快的原理來分離的，但是這種方法對(duì)于性別比例的改變并不是十分明顯，因此存在爭議（White et al.， 1984；石磊和岳文斌，2007）。免疫法是根據(jù)H-Y抗原特異表達(dá)于Y細(xì)胞膜上，利用H-Y抗體來檢測(cè)抗原，但是有研究表明X也能結(jié)合抗H-Y抗原抗體，因此，在本質(zhì)上X、Y會(huì)共享抗原（Zavos，1983；Hendriksen，1999）。
目前比較理想的方法是流式細(xì)胞儀分類法，它是根據(jù)X、YDNA含量的微小差異來分離的，是當(dāng)前分離純度最高的一種方法，一般分離率可達(dá)70～90%，而且分離后的仍具有發(fā)育能力，其主要缺點(diǎn)是分離速度慢、時(shí)間較長、成本高難以商業(yè)化（馮伯森等，2000；George et al.， 2002； 張明和盧克煥，2003；陸陽清等，2005）。
2.2胚胎性別鑒定
胚胎性別鑒定的主要方法有核型分析法，X-相關(guān)酶法，免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法等。核型分析法通過查明胚胎細(xì)胞的性染色體類型為XX型和XY型來鑒定胚胎的性別，該方法準(zhǔn)確率高，幾乎可達(dá)到100%，但操作繁瑣，對(duì)胚胎有一定的傷害，不適合生產(chǎn)實(shí)際，目前主要用來驗(yàn)證其它性別鑒定方法的準(zhǔn)確率（葛寶生等，1998；華進(jìn)聯(lián)等，1999）。X-相關(guān)酶法是通過測(cè)定與X染色體相關(guān)的酶活性來鑒定雌性胚胎的一種方法，其依據(jù)是：在胚胎發(fā)育早期，雌性的一條X染色體失活；在胚胎基因組的激活和X一染色體失活之間的短暫時(shí)期內(nèi)，雌性的兩條X一染色體都可以被轉(zhuǎn)錄和翻譯，這表明在雌性胚胎中與X一染色體相連的酶細(xì)胞內(nèi)活性是雄性的兩倍，但這種方法中測(cè)定次黃漂吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶對(duì)致密桑套胚或囊胚階段的胚胎應(yīng)用有困難，難以確定X染色體失活的準(zhǔn)確時(shí)間，并且還具有潛在的細(xì)胞毒性（魏雅萍，2003；張傳生和杜立新，2001；馮伯森等，2000）。
免疫學(xué)方法是利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測(cè)胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而鑒定胚胎性別的一種方法，它包括間接免疫熒光法和細(xì)胞毒性分析法（Hossepian，1993）。間接免疫熒光法先將胚胎在H-Y抗血清或單克隆抗體中培養(yǎng)，再用異硫氰酸鹽熒光標(biāo)記的免疫球蛋白IgM處理， 然后在熒光顯微鏡下檢查胚胎是否帶有熒光素， 若有則判定為H一Y+胚胎， 不顯熒光則為H一Y-胚胎。這種方法雖然不損害胚胎，準(zhǔn)確率高，但是具有一定的主觀性（馮伯森等，2000）。細(xì)胞毒性分析的原理是在補(bǔ)體存在的情況下，H一Y抗體可以和H-Y陽性雄性胚胎結(jié)合并使卵裂球溶解，而仍能正常發(fā)育的為雌性胚胎。但是這種方法對(duì)細(xì)胞殺傷作用，已很少采用（馮伯森等，2000；張光勤和李建民，2002）。分子生物學(xué)方法是近十幾年發(fā)展起來的一種利用雄性特異性SRY基因和PCR擴(kuò)增技術(shù)鑒定性別的一種方法。擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)，能擴(kuò)增出序列的為雄性，反之為雌性。這種方法靈敏度高， 準(zhǔn)確率高，是目前為止最為理想的胚胎性別鑒定方法之一（魏雅萍，2003）。
3性別控制的意義
性別控制具有重大的意義，其一，可以大大提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。畜牧業(yè)生產(chǎn)中不同性別的家畜有不同的用途，因此可運(yùn)用此技術(shù)提高大量雌性個(gè)，如奶牛、母雞的數(shù)量，而且可以節(jié)約雄性個(gè)體在繁殖年度的飼料消耗。相，雄性肉牛，綿羊和豬等增重要快，肉質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)也可通過此技術(shù)控制多產(chǎn)雄比后代。并且可以有效的防止牛的異性孿生不育癥。其二，可以排除動(dòng)物群體中的有害基因，預(yù)測(cè)和控制家畜的遺傳和表型性別，增加選育強(qiáng)度，獲得最大的遺傳進(jìn)展。其三，控制性別與胚胎移植，胚胎冷凍等技術(shù)的應(yīng)用，可加速瀕危動(dòng)物，珍稀動(dòng)物的繁殖和保種進(jìn)程。.性別控制也是體外受精，核移植單精注射及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一項(xiàng)配套技術(shù)，它的應(yīng)用必將促進(jìn)其它生物技術(shù)的發(fā)展。
我國是個(gè)發(fā)展中國家，奶、肉人均消費(fèi)長期曾低于世界平均水平，近年來經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，我國對(duì)奶、肉的需求量巨增，通過性別控制技術(shù)來快速繁殖性別控制后代，能更好地滿足社會(huì)快速的需求增長（文國藝，2004）。
4問題及其發(fā)展前景
性別主要是由遺傳決定的，目前家畜的性別控制技術(shù)已在商業(yè)上應(yīng)用，并且已成為畜牧業(yè)發(fā)展中的主要技術(shù)之一。盡管應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離已取得了很大進(jìn)展，但是性別控制技術(shù)在生產(chǎn)中的普及還存在許多限制性的因素，如成本高，耗時(shí)長，技術(shù)要求高等。我們可以通過添加飼料營養(yǎng)或堿性飼料、添加微量元素、按摩、提高冷凍的解凍溫度等措施來提高產(chǎn)雌率（齊義信和李愛蕓，2001；趙峰，2002；白海湖，1997；姜忠玲，2004）。
畜牧業(yè)的發(fā)展促進(jìn)了家畜性別控制的研究，目前動(dòng)物的性別控制技術(shù)已取得了一定成果，但距離對(duì)生物性別進(jìn)行有效控制或使用胚胎性別鑒定達(dá)到實(shí)用化水平還有一定差距。運(yùn)用流式細(xì)胞分離法和SRY基因PCR擴(kuò)增法是準(zhǔn)確而發(fā)展前景比較廣闊的性別控制方法，但是分離速度較慢，因此，需要提高速度以便在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，同時(shí)加強(qiáng)與體外受精和顯微受精技術(shù)的結(jié)合，從而提高的利用率。運(yùn)用SRY基因PCR技術(shù)鑒定胚胎性別關(guān)鍵在于提高靈敏度減少細(xì)胞取樣對(duì)胚胎的損傷，取樣胚胎冷凍后移植妊娠率等。另外， 需要研究家畜SRY基因PCR擴(kuò)增試劑盒，使這種方法的操作簡單而實(shí)用，同時(shí)廣泛的進(jìn)行研究運(yùn)用胚胎工程等學(xué)科的前沿技術(shù)來提高性別控制的準(zhǔn)確率，將在畜牧業(yè)上得到廣泛的應(yīng)用?？梢韵嘈牛S著研究的深入和相關(guān)生物技術(shù)的發(fā)展，效果耿介穩(wěn)定的性別控制技術(shù)是可以實(shí)現(xiàn)的，并且哺乳動(dòng)物的性別控制技術(shù)與胚胎移植技術(shù)、體外受精技術(shù)、胚胎冷凍技術(shù)相結(jié)合將會(huì)共同推動(dòng)畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)化的前進(jìn)。
參考文獻(xiàn)：
[1]George E， Seidel Jr， Duanel. Current status of sexing mammalian spermatozoa. Reproduction，2002， 124（6）： 733-743.
[2]Hendriksen P J M. Do X and Y spermatozoa differ in proteins. Theriogenology， 1999， 52： 1295-1307.
[3]White K L et al. Immunofluorescent detection of a male specific factor on preimplantation bovine embryos. Theriogenology， 1984， 21： 275.
[4]Zavos P M. Preconception sex determination via intravaginal administration of H-Y antisera in rabbits. Theriogenology， 1983， 20： 235-240.
[5]白海湖. 與性別有關(guān)的鎘元素. 榆林高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)， 1997， 9（2）.
[6]馮伯森， 王秋雨， 胡玉興編， 著. 動(dòng)物細(xì)胞工程原理與實(shí)踐. 北京： 科學(xué)出版社， 2000， 90-95.
[7]葛寶生， 李善如， 張忠誠等. 哺乳動(dòng)物的性別控制. 內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)， 1998， 2： 14-17.
[8]華進(jìn)聯(lián)， 鄭茂， 竇忠英. 家畜早期胚胎性別鑒定. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 1999， 8： 9-11.
[9]姜忠玲， 王國志. 奶牛性別控制的研究途徑與現(xiàn)狀. 黑龍江動(dòng)物繁殖， 2004， 12（2）： 10-12.
[10]陸陽清， 張明， 盧克煥. 流式細(xì)胞儀分離法的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào)， 2005， 176（3）： 26-30.
[11]楔田博司等。第1回家畜繁殖技術(shù)研究會(huì)大會(huì)要旨。1987.
[12]齊義信， 李愛蕓， 齊魯全， 等. 家畜性比的綜合控制技術(shù). 中國奶牛， 2001， 5： 34-36.
[13]石磊， 岳文斌. X、Y分離性別控制技術(shù)研究進(jìn)展. 上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2007， 2： 6-7.
[14]魏雅萍. 畜胚胎早期性別鑒定的方法. 青海畜牧獸醫(yī)雜志， 2003， 33（1）： 41-42.
[15]文國藝. 動(dòng)物性別控制任重而道遠(yuǎn). 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué). 2004， 21（6）： 1-2.
[16]巖崎說雄等. 第79回日畜學(xué)會(huì)大會(huì)要旨. 1987： 135.
[17]張傳生， 杜立新. 哺乳動(dòng)物性別決定機(jī)理及性別鑒定方法研究進(jìn)展. 黃牛雜志， 2001， 27（3）： 38-42.
[18]張紅衛(wèi)， 王子仁， 張士璀， 等. 發(fā)育生物學(xué)， 北京： 高等教育出版社， 2001， 334-340.
[19]朱曉華， 趙萬里， 王志躍. 家畜性別決定的機(jī)制及其控制的研究進(jìn)展. 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)， 2001， 18（1）： 22-24.
[20]朱必才， 高建國， 張子峰， 等. 哺乳動(dòng)物性別決定及其機(jī)制的研究. 細(xì)胞生物學(xué)雜志， 2002， 24（5）： 282-286.
[21]趙峰. 奶牛性別控制技術(shù)研究及其利用. 中國奶牛， 2002， 2： 31-33.
[22]張光勤， 李建民. 哺乳動(dòng)物XY分離技術(shù)的研究進(jìn)展. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2002， 36（2）： 168-171.
【關(guān)鍵詞】進(jìn)化生物學(xué) 課程 教學(xué)改革
【中圖分類號(hào)】G642.0 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-4810（2014）14-0025-02
進(jìn)化生物學(xué)是在生物進(jìn)化論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門學(xué)科。20世紀(jì)后期，隨著遺傳學(xué)、生物化學(xué)，尤其是分子生物學(xué)的發(fā)展，推動(dòng)生物進(jìn)化論從推理到驗(yàn)證，從定性到定量，使得這門學(xué)科由模糊的理論推測(cè)日漸發(fā)展為脈絡(luò)清晰的系統(tǒng)學(xué)科。它從各門功能生物學(xué)科獲得研究基礎(chǔ)，綜合形成的一般規(guī)律和理論又成為整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展線索。邁爾曾說：“進(jìn)化生物學(xué)是生命科學(xué)中的最大的統(tǒng)一理論”，是建立在生命科學(xué)各層次研究和各分支學(xué)科基礎(chǔ)之上的理論綜合。由于進(jìn)化生物學(xué)涉及學(xué)科廣泛，是高度概括的綜合性理論，實(shí)踐環(huán)節(jié)存在困難等原因，導(dǎo)致進(jìn)化生物學(xué)教學(xué)有其獨(dú)特性，本文從教學(xué)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，就進(jìn)化生物學(xué)課程改革方面進(jìn)行探索。
一 課程目標(biāo)的設(shè)置
針對(duì)進(jìn)化生物學(xué)既是生命學(xué)科各分支學(xué)科的綜合，也是生命科學(xué)領(lǐng)域的一門前沿學(xué)科，又是生命科學(xué)的一個(gè)核心理論的課程特點(diǎn)，在課程目標(biāo)的設(shè)置上力求做到以下三點(diǎn)：
1.牢固掌握本課程基礎(chǔ)知識(shí)和理論
主要包括生命及其在地球上的起源、細(xì)胞的起源與進(jìn)化、生物發(fā)展歷程、微觀進(jìn)化、宏觀進(jìn)化、遺傳系統(tǒng)的進(jìn)化及人類起源等問題，這些知識(shí)既是進(jìn)化生物學(xué)教學(xué)的主要內(nèi)容，也是學(xué)生學(xué)習(xí)的重點(diǎn)所在。這些內(nèi)容涵蓋了各門生物學(xué)分支學(xué)科的成就，特別是把植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等結(jié)合起來研究有關(guān)生命進(jìn)化的問題，力求讓學(xué)生在掌握生命進(jìn)化的基本歷程、進(jìn)化的動(dòng)力機(jī)制，學(xué)會(huì)對(duì)進(jìn)化現(xiàn)象進(jìn)行正確的理論分析的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)對(duì)生命科學(xué)各分支學(xué)科融會(huì)貫通的能力。
2.密切結(jié)合生命科學(xué)研究中各學(xué)科的最新研究進(jìn)展
進(jìn)化生物學(xué)是生命科學(xué)中一個(gè)相當(dāng)活躍的領(lǐng)域，新知識(shí)、新理論層出不窮。本課程以現(xiàn)代達(dá)爾文綜合進(jìn)化論為基礎(chǔ)，同時(shí)密切結(jié)合生命科學(xué)研究中的最新進(jìn)展，把各個(gè)學(xué)科前沿進(jìn)展融入教學(xué)過程中，如以鳥類手指同源問題講解物種特化式進(jìn)化中的分歧進(jìn)化，在“適應(yīng)”的問題上聯(lián)系燕子為躲避車輛進(jìn)化出更短的翅膀等，把一些最新進(jìn)展融入理論教學(xué)中，不僅增強(qiáng)學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解與學(xué)習(xí)興趣，更能開拓學(xué)生的知識(shí)層面，也體現(xiàn)了進(jìn)化生物學(xué)是一門前沿學(xué)科的地位，吸引學(xué)生從事進(jìn)化生物學(xué)的研究。
3.著重培養(yǎng)學(xué)生對(duì)自然界進(jìn)化過程的正確認(rèn)識(shí)和理解
進(jìn)化生物學(xué)是在哲學(xué)思想指引下產(chǎn)生的，研究進(jìn)化的過程本身就是將古論今，“現(xiàn)在就是過去的鑰匙”，通過學(xué)習(xí)能夠加深對(duì)生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的正確理解，單獨(dú)的思想教育往往說服力不足，課程中引入大量的數(shù)據(jù)和事實(shí)，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)問題的分析能力，如讓學(xué)生從微觀進(jìn)化角度對(duì)生物多樣性進(jìn)行分析，探討生物大滅絕對(duì)生物環(huán)境保護(hù)的意義，從人類進(jìn)化歷程角度談如何摒棄“為人獨(dú)尊”的思想等，把這種思想的教育貫穿始終，幫助學(xué)生樹立科學(xué)的世界觀，這也是對(duì)辯證唯物主義自然觀最好的驗(yàn)證。
二 優(yōu)化課程內(nèi)容體系
進(jìn)化生物學(xué)研究內(nèi)容貫穿生命科學(xué)的各個(gè)分支學(xué)科，甚至其他自然科學(xué)和社會(huì)科學(xué)門類中都會(huì)觸及生命起源及進(jìn)化的問題。在國外很多大學(xué)都把進(jìn)化生物學(xué)列為生物學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)課、研究生基礎(chǔ)課，甚至成為一門通識(shí)課。耶魯大學(xué)開放課程進(jìn)化、生態(tài)和行為原理從2009年錄制以來風(fēng)靡全球。
――――――――――――――――――――――――――
* 基金項(xiàng)目：大慶師范學(xué)院教育教學(xué)改革項(xiàng)目（編號(hào)：JY1320）
在我國，很多高師院校把進(jìn)化生物學(xué)課程設(shè)置為生物科學(xué)專業(yè)必修課，一般在學(xué)習(xí)最后階段開設(shè)；也作為生物學(xué)其他專業(yè)，如生物技術(shù)、生物工程的選修課，也有院校將生命起源與進(jìn)化之謎作為一門通識(shí)課來開設(shè)。由于進(jìn)化生物學(xué)融匯眾多交叉學(xué)科，每個(gè)學(xué)校學(xué)科課程設(shè)置各有不同，教材內(nèi)容不可能完全適應(yīng)具體情況，不同學(xué)校不同專業(yè)的課程內(nèi)容不能一味照搬。我院曾把進(jìn)化生物學(xué)作為生物科學(xué)專業(yè)必修課，生物技術(shù)專業(yè)選修課和全校學(xué)生的通識(shí)課開設(shè)，在圍繞基礎(chǔ)知識(shí)和原理的基礎(chǔ)上，對(duì)課程內(nèi)容進(jìn)行了如下優(yōu)化：
1.對(duì)于生物科學(xué)專業(yè)師范生而言，進(jìn)化生物學(xué)課程在初中、高中課本都有體現(xiàn)，應(yīng)該詳盡系統(tǒng)地開設(shè)
通過對(duì)生物進(jìn)化的歷史過程、原因、機(jī)制、速率、趨向和物種的形成與絕滅、系統(tǒng)發(fā)生以及適應(yīng)的起源機(jī)制等內(nèi)容的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握生物進(jìn)化理論中的基本概念，認(rèn)識(shí)生命進(jìn)化的基本歷程、進(jìn)化的動(dòng)力機(jī)制，學(xué)會(huì)對(duì)進(jìn)化現(xiàn)象進(jìn)行正確的理論分析，融會(huì)貫通各分支學(xué)科；同時(shí)激發(fā)學(xué)生對(duì)生命科學(xué)的學(xué)習(xí)興趣，樹立科學(xué)的世界觀，培養(yǎng)具有用進(jìn)化理論來綜合生物學(xué)各個(gè)學(xué)科知識(shí)的能力的高素質(zhì)人才。
2.對(duì)于生物技術(shù)專業(yè)的學(xué)生而言，應(yīng)該有針對(duì)性地進(jìn)行開設(shè)
由于生物技術(shù)專業(yè)的學(xué)生有一定的生物學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)化生物學(xué)課程主要應(yīng)從生命史、小進(jìn)化（種內(nèi)水平的進(jìn)化）、大進(jìn)化（種以上水平的進(jìn)化）及人類的起源與演化四個(gè)主要方面講解，著重從個(gè)體、群體以及物種等不同分類群探討進(jìn)化的規(guī)律，涉及學(xué)生已掌握的細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域，加深對(duì)各個(gè)學(xué)科知識(shí)的貫通，著重對(duì)學(xué)生進(jìn)行生物進(jìn)化思想的培養(yǎng)，讓學(xué)生對(duì)生物進(jìn)化的本質(zhì)有一個(gè)科學(xué)的認(rèn)識(shí)，培養(yǎng)適應(yīng)新時(shí)期社會(huì)高速發(fā)展的科技人才。
3.作為一門通識(shí)課，針對(duì)生物基礎(chǔ)知識(shí)相對(duì)薄弱的學(xué)生開設(shè)，課程學(xué)時(shí)一般為18學(xué)時(shí)
課程從宏觀角度對(duì)生物的發(fā)展歷程、人類的起源與進(jìn)化等問題入手展開，介紹地球的形成與演化、環(huán)境系統(tǒng)的演變、生命的起源、生物與環(huán)境的協(xié)同關(guān)系等，展示人類探索生命起源、探索天外生命的科學(xué)成果和艱辛歷程。審視30億年來主要生物類群的延續(xù)發(fā)展，探索起源、分化和滅絕等問題，使學(xué)生樹立生物與環(huán)境相互聯(lián)系、生物具有適應(yīng)性和多樣性的觀點(diǎn)，在教學(xué)過程中加強(qiáng)辯證唯物主義的世界觀教育，使學(xué)生正確地認(rèn)識(shí)人類在自然界中的地位，人與自然協(xié)調(diào)發(fā)展的必要性，培養(yǎng)大學(xué)生探索科學(xué)的興趣，增強(qiáng)其珍惜生命和保護(hù)環(huán)境的意識(shí)。
三 課堂教學(xué)改革
進(jìn)化生物學(xué)課堂教學(xué)既要符合課堂教學(xué)的一般教學(xué)規(guī)律，又要充分體現(xiàn)課程的獨(dú)特性。在教學(xué)過程設(shè)計(jì)上將學(xué)術(shù)性與趣味性有機(jī)結(jié)合，緊密聯(lián)系生活實(shí)際，并采用靈活多變的教法，豐富的多媒體資源，讓學(xué)生展開討論和辯論等形式激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，進(jìn)一步提高課堂教學(xué)質(zhì)量。
1.課堂教學(xué)形式的改革，以學(xué)生活動(dòng)為主體，師生角色互換
進(jìn)化生物學(xué)是一門前沿的學(xué)科，有很多未知的內(nèi)容等待我們?nèi)ヌ剿?，?duì)于一些前沿的問題，如恐龍滅絕之謎，地球之外是否有生命，下一次物種大滅絕的預(yù)測(cè)等問題，讓學(xué)生自行組織，用多媒體報(bào)告的形式做介紹，各小組相互提問，并按照評(píng)價(jià)表進(jìn)行打分，小組成績就是小組成員的成績，以此培養(yǎng)團(tuán)隊(duì)精神，讓學(xué)生真正融入其中，真正落實(shí)“以學(xué)生為主體”的教育理念。
2.靈活運(yùn)用現(xiàn)代教學(xué)手段，提高教學(xué)質(zhì)量和效率
對(duì)現(xiàn)代教學(xué)手段的大規(guī)模應(yīng)用還存在褒貶不一的看法，但對(duì)于進(jìn)化生物學(xué)課程而言，選擇有代表性的圖片、音像資料能吸引學(xué)生注意力，豐富課堂內(nèi)容。如古生物的化石，冥古代地球表面特征等，學(xué)生理解起來有一定的難度，但用一張想象圖卻能集中學(xué)生注意力，降低學(xué)習(xí)難度。另外，借鑒并剪輯國內(nèi)外大型探索片、紀(jì)錄片、科幻片中相關(guān)內(nèi)容及其中涉及的電影片段，如《宇宙的誕生》《與遠(yuǎn)古人同行》等，這些音像資料有效地提高和調(diào)動(dòng)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，也為進(jìn)一步探討一些科學(xué)問題提供了證據(jù)和平臺(tái)。多媒體課件具有信息豐富、形象、通俗易懂等特點(diǎn)，學(xué)生易于接受，便于他們掌握重點(diǎn)內(nèi)容。
3.教學(xué)過程與觀察、實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，注重實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)
作為一門理論學(xué)科，必須要有實(shí)踐環(huán)節(jié)的支持，而生物進(jìn)化的歷程有數(shù)十億年之久，無法真實(shí)再現(xiàn)當(dāng)時(shí)的情境，這成了進(jìn)化生物學(xué)實(shí)踐環(huán)節(jié)的難題。課堂教學(xué)主要從基礎(chǔ)課程植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)實(shí)踐教學(xué)展開，通過對(duì)以往知識(shí)的回顧、實(shí)踐結(jié)果的描述和多媒體圖片視頻展示，讓學(xué)生對(duì)生物進(jìn)化歷程有一個(gè)初步的認(rèn)識(shí)。對(duì)于有些歷史階段沒有化石等直接證據(jù)，則利用解剖學(xué)、胚胎學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等知識(shí)內(nèi)容，從現(xiàn)存的狀況去推斷過去的事件，如利用系統(tǒng)生物學(xué)方法通過對(duì)現(xiàn)生類群的研究，推斷生物的系統(tǒng)發(fā)育。還可以帶領(lǐng)學(xué)生參觀博物館、地質(zhì)館，通過研究已滅絕的生物骨骼化石標(biāo)本和對(duì)不同地質(zhì)斷層進(jìn)行分析比較的活動(dòng)，讓學(xué)生獲取最直觀的認(rèn)識(shí)，總的來看，效果還不錯(cuò)。
四 展望
進(jìn)化生物學(xué)從探索生命起源出發(fā)，融會(huì)眾多學(xué)科內(nèi)容，以哲學(xué)思想概括總結(jié)出理論知識(shí)，通過認(rèn)識(shí)生命來源和歷程，從而加深理解生命和尊重生命，以進(jìn)化的思想升華生態(tài)環(huán)境保護(hù)的意識(shí)，樹立人類發(fā)展必須自覺地順從并維護(hù)生物與環(huán)境的協(xié)同演化的觀點(diǎn)，對(duì)于培養(yǎng)大學(xué)生系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)自然界具有重要意義。建議除了在生物相關(guān)專業(yè)開設(shè)必修課和選修課外，還應(yīng)該在醫(yī)學(xué)院校、師范院校和綜合性院校廣泛開設(shè)公共通識(shí)課，特別是在將來從事科普工作、小學(xué)幼兒教育、心理學(xué)等相關(guān)行業(yè)工作的學(xué)生中開設(shè)通識(shí)課，以此培養(yǎng)學(xué)生樹立人與環(huán)境和諧可持續(xù)發(fā)展的觀念，建立正確的世界觀、人生觀、價(jià)值觀。
參考文獻(xiàn)
【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞
干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞的用途非常廣泛，涉及到醫(yī)學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域。目前科學(xué)家已經(jīng)能夠在體外鑒別、分離、純化、擴(kuò)增和培養(yǎng)人體胚胎干細(xì)胞，并以這樣的干細(xì)胞為“種子”，培育出一些人的組織器官。干細(xì)胞及其衍生組織器官的廣泛臨床應(yīng)用，將產(chǎn)生一種全新的醫(yī)療技術(shù)，也就是再造人體正常的甚至年輕的組織器官，從而使人能夠用上自己的或他人的干細(xì)胞或由干細(xì)胞所衍生出的新的組織器官，來替換自身病變的或衰老的組織器官。本文將對(duì)腫瘤干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞的研究做如下綜述。
1、腫瘤干細(xì)胞概述
1.1腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出。1960年以來，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明只有當(dāng)腫瘤細(xì)胞數(shù)大于100萬時(shí)才可以形成新的腫瘤。一些研究顯示并不是所有的腫瘤細(xì)胞都能增殖，可能只有小部分腫瘤細(xì)胞具有滯留源性，而大部分是腫瘤起始細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞之間具有許多共同特征：他們都具有多向分化潛能和自我更新能力，以及相似的細(xì)胞表面標(biāo)志和相同的信號(hào)調(diào)節(jié)通路等[1]。于是提出腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞，是一種干細(xì)胞疾病，腫瘤是正常干細(xì)胞累計(jì)突變的結(jié)果，“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說”應(yīng)運(yùn)而生。
1.2腫瘤干細(xì)胞的分離和鑒定。近年來，干細(xì)胞研究的發(fā)展很大程度上依賴于細(xì)胞分化抗原的研究進(jìn)展，細(xì)胞表面特異性標(biāo)志的確定是腫瘤干細(xì)胞分離的第一步。一般原則為結(jié)合譜系標(biāo)志，正常干細(xì)胞特異標(biāo)志（如BTSC的CD133與分離LSC的CD34）以及正常組織特異性標(biāo)志等綜合評(píng)價(jià)[2]，很多學(xué)者認(rèn)為結(jié)合陽性標(biāo)志和陰性標(biāo)志可以更有效地分離干細(xì)胞。目前高通量的細(xì)胞分選系統(tǒng)主要有：磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)和流式細(xì)胞技術(shù)（FACS）[3]。
1.3腫瘤干細(xì)胞研究方向。①研究論證是否每一種腫瘤細(xì)胞，不論是良惡性都存在腫瘤干細(xì)胞。②確定細(xì)胞表面標(biāo)志，爭取使用特異性強(qiáng)的藥物殺滅腫瘤干細(xì)胞。③對(duì)已分離鑒定的腫瘤干細(xì)胞，從其特性入手，即誘導(dǎo)其分化，使其喪失自我更新的能力。④研究表明，Notch、wnt、Shh、Bmil等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)到通路調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞的自我更新、增生、分化，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。通過研究這些細(xì)胞信號(hào)通路，有助于我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞的靶位用于抗癌治療。⑤發(fā)展高效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)以及維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)技術(shù)是今后研究的重任。目前實(shí)體瘤中的乳腺癌干細(xì)胞和淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤干細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)并分離，但隨后需進(jìn)一步證實(shí)更多實(shí)體瘤腫瘤干細(xì)胞的存在，并從腫瘤中分離純化腫瘤干細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上確定腫瘤干細(xì)胞的基因圖譜，尋找腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出來的特異靶位，研制新的針對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的藥物，以達(dá)到腫瘤的根治療效。
2、心肌干細(xì)胞概述
2.1心肌干細(xì)胞簡介。2003年，Beltrami等首次從大鼠心肌內(nèi)分離出一種具有自我更新能力的細(xì)胞，并具有分化成心肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞的能力。將這些細(xì)胞移植到心肌梗死大鼠心肌內(nèi)，可分化成新的心肌細(xì)胞并明顯改善心臟功能。這類細(xì)胞認(rèn)為是心肌干細(xì)胞。Laflamme等的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)成人心臟中有心肌干細(xì)胞的存在，它能夠再生心肌，并且損傷時(shí)這種修復(fù)功能會(huì)增加[4]。Laugwitz等則證實(shí)心臟間質(zhì)中存在著能完全分化成心肌表型的祖細(xì)胞。這些不同研究結(jié)果均表明了人類的成年心肌內(nèi)都存在具有多向分化潛能的心肌干細(xì)胞。
2.2心肌干細(xì)胞分化起源。胚胎干細(xì)胞時(shí)全能干細(xì)胞能分化幾乎全部組織和器官。1981年，鼠的胚胎干細(xì)胞首次分離成功。1998年Thomson首次從人囊胚中分離出人類胚胎干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞可以體外分化為心肌細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也可以分化成心肌干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)骨髓源性祖細(xì)胞能夠想造血細(xì)胞，血管和心肌等直接分化[5]。
2.3心肌細(xì)胞的定向分化及其調(diào)控。心肌干細(xì)胞向心肌分化受到多種因素的誘導(dǎo)和調(diào)控，目前已知細(xì)胞因子，激素，藥物以及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子等都可以參與心急干細(xì)胞的分化調(diào)控。例如催產(chǎn)素可以與心肌干細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)干細(xì)胞的有絲分裂；骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一類在胚胎發(fā)育過程中起重要作用的蛋白家庭，它們可以參與調(diào)節(jié)某些心臟轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，對(duì)心肌干細(xì)胞的定向分化起重要作用。
3、神經(jīng)干細(xì)胞概述
3.1神經(jīng)干細(xì)胞來源。①來源于腦組織，包括胚胎腦組織和成人腦組織；②來源于精髓。在胚胎和成人的脊髓室管內(nèi)都存在神經(jīng)肝細(xì)胞；③來源于骨髓。骨髓中存在骨髓基質(zhì)肝細(xì)胞，在特定的條件下可以跨系統(tǒng)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；④臍血。人臍血是胎兒出生時(shí)期胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的肝細(xì)胞；⑤其他來源。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，臍帶華兒通膠來源的基質(zhì)細(xì)胞有與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞相似的特性[6]。
3.2神經(jīng)干細(xì)胞的分化。目前絕大多數(shù)的研究者認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞的分化存在細(xì)胞自身基因調(diào)控和外源性信號(hào)調(diào)控兩種基質(zhì)。這兩種調(diào)控方式不斷相互作用，共同完成對(duì)肝細(xì)胞分化的控制?，F(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞分化研究還沒有形成一個(gè)完全可靠的系統(tǒng)，僅僅只是就某一個(gè)途徑或細(xì)胞因子等的研究。這主要是由于體內(nèi)有上百種類型的神經(jīng)元，每一種神經(jīng)元的分化過程均涉及多種影響因素和信號(hào)傳遞。誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞高效分化成目的神經(jīng)元或特定類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞仍處于探索階段。
3.3神經(jīng)干細(xì)胞研究前景。神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在被證明，以及分離培養(yǎng)的成功是神經(jīng)科學(xué)研究的一個(gè)重要突破。目前神經(jīng)干細(xì)胞的研究公正如火如荼地進(jìn)行，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究取得顯著成果，但是將其常規(guī)應(yīng)用于臨床仍有許多問題需要解決，以及如何從動(dòng)物的應(yīng)用順利的過度到臨床的應(yīng)用還需要進(jìn)行深入的研究。
4、結(jié)語與展望
干細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種發(fā)育全能性細(xì)胞。目前對(duì)干細(xì)胞的研究取得的進(jìn)展都是在闡明干細(xì)胞的生物學(xué)特性，以及對(duì)干細(xì)胞的選擇性分化和生長，然而如何對(duì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行很好的控制還沒弄清楚，這需要人們進(jìn)一步研究和探索。隨著基因工程、胚胎工程、細(xì)胞工程等各種生物技術(shù)的快速發(fā)展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養(yǎng)干細(xì)胞已成為可能，利用干細(xì)胞構(gòu)建各種細(xì)胞、組織、器官作為移植器官的來源，這將成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。
【參考文獻(xiàn)】
[1]農(nóng)曉林，黎彥，等.腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)文摘腫瘤學(xué)，2006，20（3）：241-242.
[2]Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.A cell initiating human acute myeliod leukaemia after transplantation into SCID mice.Nature，1994，367；645-648.
[3]Al-Hajj M，Wicha M S，Benito-Hemandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer ceils[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（7）：3983-88.
[4] Laflamme MA，Gold J，Xu C，et al.Formation of human myocardium in the rat heart form human embryonic stem cells[J].Am J Pathol，2005，167（3）：663.
【關(guān)鍵詞】兒童早期綜合發(fā)展；嬰兒；智能發(fā)育
【中圖分類號(hào)】R 179 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004―7484（2013）09―0642―02
1 對(duì)象和方法
1.1 對(duì)象 選擇本院門診1個(gè)月到4個(gè)月嬰兒217例，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組113例和對(duì)照組104例，跟蹤至12個(gè)月。其中實(shí)驗(yàn)組男64名、女49名，對(duì)照組男58名、女46名。兩組母親妊娠期無重大疾病，嬰兒為出生體重≥2500g的正常新生兒，排除核黃疸、驚厥及與發(fā)育相關(guān)遺傳疾病的新生兒。兩組出生體重和出生情況、家庭環(huán)境等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.2方法
1.2.1分組方法：采用縱向?qū)φ昭芯康姆椒?，分為?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
1.2.2實(shí)驗(yàn)組的實(shí)施內(nèi)容
1.2.2.1實(shí)驗(yàn)組由兒保醫(yī)師對(duì)其家長進(jìn)行兒童早期綜合發(fā)展指導(dǎo)：包括兒童系統(tǒng)保健管理、智能發(fā)育指導(dǎo)、撫觸、被動(dòng)操、親子活動(dòng)、疾病預(yù)防措施及親子教育宣教等。對(duì)照組嬰兒進(jìn)行常規(guī)的兒童系統(tǒng)保健管理。兩組嬰兒均于出生后4至12個(gè)月期間接受體重、身長、頭圍測(cè)量及智能測(cè)試。
1.2.2.2 根據(jù)營養(yǎng)狀況評(píng)價(jià)結(jié)果、體格發(fā)育評(píng)價(jià)、神經(jīng)精神發(fā)育評(píng)估結(jié)果及年齡特點(diǎn)進(jìn)行綜合性早期潛能開發(fā)指導(dǎo)。以鮑秀蘭教授《挖掘兒童潛能始于零歲》為藍(lán)本、參照福建省婦幼保健院修訂的“嬰幼兒智能開發(fā)與發(fā)育簡明表”指導(dǎo)家長對(duì)新生兒進(jìn)行視、聽刺激訓(xùn)練。1個(gè)月后到早教和干預(yù)門診建立系統(tǒng)檔案，由早教醫(yī)師為每個(gè)孩子進(jìn)行一對(duì)一指導(dǎo)，根據(jù)每個(gè)孩子的個(gè)性特點(diǎn)及不同年齡段的生長發(fā)育特點(diǎn)，通過做體操和用玩具、器材對(duì)嬰兒進(jìn)行感知覺、語言、手功能、大運(yùn)動(dòng)及社交能力等方面提供具有個(gè)性化的指導(dǎo)意見及適宜的計(jì)劃給家長，教會(huì)兒童家長實(shí)施家庭訓(xùn)練。
1.2.2.3 每月舉辦一次科學(xué)育兒講座，給家長介紹適齡益智玩具、書刊、畫報(bào)，普及宣傳常見病的預(yù)防知識(shí)，接受早期教育的重要性、嬰兒智能發(fā)育規(guī)律及如何開發(fā)嬰兒潛能的知識(shí)培訓(xùn)，并發(fā)給家長健康教育處方。
1.2.2.4 開辦親子園，邀請(qǐng)家長參加每周一次親子活動(dòng)。親子園主要開展形式多樣、豐富多彩的趣味游戲，培養(yǎng)嬰兒的觀察力、創(chuàng)造力、記憶力、思維能力和社交能力。
1.2.3測(cè)量方法：
1.2.3.1智能測(cè)驗(yàn)：兩組嬰兒均于4至12月期間采用首都兒科研究所研發(fā)的“0～6歲小兒神經(jīng)心理發(fā)育量表”。
1.2.3.2體格生長指標(biāo)測(cè)量：12個(gè)月進(jìn)行體重、身長、頭圍測(cè)量。
1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)，P
1.2.5 質(zhì)量控制：兩組嬰兒均由一位經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)、獲得合格證書的醫(yī)生，采用“0～6歲小兒神經(jīng)心理發(fā)育量表”，進(jìn)行嬰兒智能發(fā)育測(cè)驗(yàn)。
2 結(jié)果
嬰兒智能總發(fā)育商和各能區(qū)發(fā)育商的比較：兩組嬰兒總的發(fā)育商，實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
3 討論
3.1嬰兒智能發(fā)育是先天遺傳和后天環(huán)境因素相互作用不斷積累的過程，嬰兒智能發(fā)育的水平是由生物學(xué)因素、行為特征和家庭環(huán)境質(zhì)量相互作用決定的。近年來腦科學(xué)的發(fā)展和嬰兒心理學(xué)的研究進(jìn)展，為早期綜合發(fā)展奠定了生理和心理方面的理論依據(jù)。腦科學(xué)的研究表明，嬰兒期是腦發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵期，在這一時(shí)期按心理發(fā)展年齡為嬰兒提供豐富的各種感官刺激、語言環(huán)境、知覺辨別能力、適應(yīng)能力及創(chuàng)造動(dòng)手和身體大動(dòng)作的機(jī)會(huì)，充分發(fā)掘大腦潛能，對(duì)嬰兒的神經(jīng)心理發(fā)育無疑具有推動(dòng)作用。因此給予嬰兒提供豐富的感官刺激、語言環(huán)境和適宜的認(rèn)知能力、社會(huì)適應(yīng)能力等鍛煉，可促進(jìn)嬰兒的神經(jīng)心理發(fā)育，使腦潛能得到充分的發(fā)揮，從而提高智力水平。
3.2 本研究兩組嬰兒在生物學(xué)和環(huán)境因素方面做了較嚴(yán)格的對(duì)照，條件基本相同。生物學(xué)因素方面：研究對(duì)象在出生后不久，通過詳細(xì)詢問病史和體檢，符合正常足月新生兒標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格排除圍產(chǎn)期高危因素。出生后到12個(gè)月經(jīng)過密切隨診，未發(fā)現(xiàn)嬰兒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其他重大疾病，體格發(fā)育主要指標(biāo)均正常，因此兩組嬰兒基本上排除了生物學(xué)不良因素對(duì)智能的影響。而影響嬰兒智能發(fā)育的主要因素，如性別、家庭結(jié)構(gòu)大小、居住環(huán)境兩組相仿均衡，因此兩組智能結(jié)果是有可比性。本研究顯示實(shí)驗(yàn)組的發(fā)育商比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明早期綜合發(fā)展確實(shí)能促進(jìn)嬰兒智力發(fā)育，與國內(nèi)其他研究結(jié)果一致[1，2]。
3.3 育兒存在的問題：部分家長存在錯(cuò)誤的育兒觀念：①捆綁肢體限制嬰兒
活動(dòng)，給嬰兒戴手套，過多抱著嬰兒，不敢讓其有俯臥、翻身、坐爬等活動(dòng)，束縛了嬰兒探索世界的能力，限制其大運(yùn)動(dòng)及精細(xì)運(yùn)動(dòng)發(fā)展，也容易導(dǎo)致日后感覺綜合失調(diào)；②長時(shí)間不洗澡、不洗頭，使嬰兒缺乏對(duì)水的觸覺感，同時(shí)又引起生理上的不舒適感，導(dǎo)致嬰兒產(chǎn)生愛哭、煩躁、不愿與人交流等情緒障礙。③缺少交流，將嬰兒交給保姆、老人，以滿足嬰兒吃喝拉睡的基本需要為限，忽視親子交流、情感的培養(yǎng)。早期綜合發(fā)展是通過科學(xué)喂養(yǎng)，有目的的豐富環(huán)境教育活動(dòng)來促進(jìn)嬰兒身心全面發(fā)育，根據(jù)嬰兒發(fā)育特點(diǎn)，因勢(shì)利導(dǎo)，開發(fā)各種能力，而不是有些家長片面理解的早期綜合發(fā)展就是早教簡單的讓小孩早認(rèn)字、讀書。
3.4兒童的早期綜合發(fā)展應(yīng)該以社區(qū)為依托，充分發(fā)揮社區(qū)的資源優(yōu)勢(shì)。目前較多社區(qū)仍采用傳統(tǒng)的4：2：1保健體檢模式，這種模式內(nèi)容僵化單一，提供的資訊極為有限，不能滿足兒童實(shí)際的發(fā)展需要。家長對(duì)體格發(fā)育、智能評(píng)價(jià)與指導(dǎo)、親子教育等服務(wù)內(nèi)容的需求較高，而且也對(duì)嬰兒撫觸、親子早教課堂等新興的早期教育服務(wù)項(xiàng)目表現(xiàn)出很大興趣。但是傳統(tǒng)的社區(qū)兒童保健工作中并未涉及此類更為全面、更有針對(duì)性的服務(wù)項(xiàng)目，服務(wù)的內(nèi)容與家長需求存在脫節(jié)。本研究通過早期綜合發(fā)展模式，根據(jù)孩子的個(gè)體情況采取保教結(jié)合，并制定個(gè)體化成長計(jì)劃，定期進(jìn)行體格檢查、神經(jīng)心理發(fā)育測(cè)查與指導(dǎo)、嬰兒體操等，并為家長開展育兒健康知識(shí)講座和親子游戲班，指導(dǎo)家長如何在家中使用益智玩具、親子游戲等早期綜合發(fā)展指導(dǎo)和干預(yù)方式。此模式可以因地制宜選取適合當(dāng)?shù)亻_展的內(nèi)容在社區(qū)兒童保健工作中推廣使用[3，4]。
參考文獻(xiàn)：
[1] 李麗霞，鮑秀蘭.北京社區(qū)0～2歲嬰幼兒早期教育效果的研究[J].中國實(shí)用兒科雜志，2001，16（3）：211-212.
[2] 王亞娜，單晉平.早期教育對(duì)嬰幼兒智能發(fā)育的影響研究.中國兒童保健雜志，2005，13（5）：408-409.
一、玉米花藥培養(yǎng)研究概況
自1964年印度Guha等從茄科植物毛曼陀羅(Datura innoxia)的離體花藥中成功誘導(dǎo)出單倍體植株以來，這一方法被廣泛應(yīng)用到28科68屬170多種植物上。我國自1974年初首次成功誘導(dǎo)玉米花粉植株，1977年，廣西玉米研究所與中國科學(xué)院植物研究所協(xié)作獲得第一株純合的玉米花粉自交果穗以來，曾一度掀起了玉米花培育種熱潮，許多學(xué)者對(duì)影響玉米花培反應(yīng)的各種因素如基因型、花粉發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基等進(jìn)行了大量研究，也獲得了花培自交系并育成了雜交種應(yīng)用于生產(chǎn)。如繼谷明光等(1975)誘導(dǎo)出第一批玉米花粉植株之后,杭玲等(1991)先后培育出玉米花培雜交種桂三1號(hào)和桂花1號(hào)。桂三1號(hào)于1992年通過廣西壯族自治區(qū)品種審定,這是國內(nèi)外用花培方法育成的第一個(gè)玉米雜交種。楊憲民(1995)利用玉米花培純系選育出優(yōu)良雜交種花單1號(hào)。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)利用花培單倍體育種技術(shù)體系成功地選育出糯玉米雜交種山農(nóng)花糯1號(hào)（王啟柏，2002）。北京市植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室玉米花培育種課題也取得了可喜的績,獲得了自交系種子（郭奕明，2001）。他們利用育成的玉米花培自交系配制的組合,抗病性強(qiáng),桿粗穗大，抗倒伏。隨著花藥培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，花培育種已與常規(guī)雜交育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、誘變育種以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展成一套獨(dú)特的育種技術(shù)體系?；ㄅ嘤N是生物技術(shù)在農(nóng)作物育種應(yīng)用最廣泛、最有效的方法之一，在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向高技術(shù)農(nóng)業(yè)的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著紐帶作用，是一種快速有效的育種途徑。
二、影響花藥培養(yǎng)效率的主要因素
1.試驗(yàn)材料
1.1 供試材料的基因型
基因型是影響花藥培養(yǎng)的主要因素之一。不同基因型的花藥對(duì)培養(yǎng)的反應(yīng)不同。杭玲等（1985）研究發(fā)現(xiàn)，接種不同材料，誘導(dǎo)率差異相當(dāng)大。在接種的241份雜交組合中，誘導(dǎo)出愈傷組織的材料為212份，占總接種材料的88%，各種材料的誘導(dǎo)率差異幅度為0.02%-100%。何雪銀等（2004）對(duì)14份糯玉米材料的花培反應(yīng)率進(jìn)行離體培養(yǎng)，有13份材料具有花培反應(yīng)，占參試材料的92.85%，出愈率在3.16~0.06%；對(duì)10份優(yōu)質(zhì)蛋白玉米材料的花培反應(yīng)率進(jìn)行離體培養(yǎng)，有5份具有花培反應(yīng)，占參試材料的50%，出愈率在0.65~0.11%。這說明在基因組內(nèi),可能存在著可調(diào)控小孢子發(fā)育的基因。
1.2 供試材料的生理狀態(tài)
供試材料的生理狀態(tài)、植株年齡、植株健壯程度、植株生長發(fā)育的生態(tài)環(huán)境（光照、溫度、大氣濕度）等各方面的因素會(huì)直接影響到愈傷組織的形成。谷明光等（1988）認(rèn)為，取樣日期不同，誘導(dǎo)物產(chǎn)生頻率差異很大。曹孜義等還認(rèn)為，即使同一天取樣時(shí)間不同，誘導(dǎo)率都不同。郭奕明等發(fā)現(xiàn)，生長在大田和溫室中以及在不同季節(jié)里的玉米，在培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)頻率都有很大差異，所以應(yīng)盡量使供體植物的種植標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)一般經(jīng)驗(yàn)，在適宜條件下生長的健康植株，其花藥和花粉培養(yǎng)的胚誘導(dǎo)率和植株再生率高。從季節(jié)上看，冬春季較夏秋季更適合進(jìn)行花藥培養(yǎng)，這可能是溫度與光周期共同作用的結(jié)果。
1.3 花粉發(fā)育時(shí)期的影響
花粉發(fā)育時(shí)期是誘導(dǎo)小孢子分裂的關(guān)鍵時(shí)期。只有花粉發(fā)育到一定時(shí)期的花藥,才對(duì)外界刺激敏感。而不同植物的花粉對(duì)外界刺激的敏感時(shí)期是不同的,如水稻、煙草的花粉,從單核中期到雙核期皆可接受誘導(dǎo),而玉米的花粉,以單核中后期為佳。此時(shí)的玉米花藥長度約4mm,顏色呈淡綠色。
2.培養(yǎng)基成分的影響
2.1基本培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)中影響花粉啟動(dòng)和再分化的重要條件，培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的成敗影響很大。在玉米花培的早期,中國科學(xué)家對(duì)各種基本培養(yǎng)基配方進(jìn)行了評(píng)估(Chu,1981;Ku,1981)。此后,N6、玉培、正14等培養(yǎng)基在玉米中都經(jīng)常用,效果也差不多。1982年，杭玲等用正交試驗(yàn)方法對(duì)培養(yǎng)基的大量元素進(jìn)行調(diào)整試驗(yàn)，篩選出“82-1”培養(yǎng)基，與N6、正14、玉培等培養(yǎng)基相比，他們認(rèn)為“82-1”培養(yǎng)基比較適合玉米花藥產(chǎn)生愈傷組織，能使80%的參試材料產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體。杭玲還指出，“82-1”培養(yǎng)基還不是最理想的培養(yǎng)基，要選擇出能廣泛適于各種基因型材料產(chǎn)生更多的愈傷組織或胚狀體的培養(yǎng)基，仍需繼續(xù)做更多試驗(yàn)。
2.2 培養(yǎng)基的附加物質(zhì)
2.2.1植物激素 在花藥培養(yǎng)中,調(diào)節(jié)激素成分不但可影響花粉發(fā)育類型,而且還可以影響到二倍體的體細(xì)胞組織生長增殖。各種研究表明,生長素(特別是2,4-D)和細(xì)胞分裂素(特別是KT或BA)的適當(dāng)比例,能促進(jìn)孢子體的小孢子發(fā)育。一般誘導(dǎo)培養(yǎng)基用生長素的適宜濃度為2mg/L,而分化培養(yǎng)基用生長素的適宜濃度為0.5mg/L。
2.2.2氨基酸 在培養(yǎng)基中加入適量的氨基酸，如丙氨酸、絲氨酸、L-羥脯氨酸，L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸等氨基酸，可以促進(jìn)愈傷組織和胚狀體的發(fā)生。
2.2.3 糖 糖作為培養(yǎng)基中的主要碳源，它不單是調(diào)節(jié)滲透壓，對(duì)花粉脫分化和再分化產(chǎn)生有利效應(yīng)。有研究報(bào)道，蔗糖濃度在12~15%是花粉脫分化培養(yǎng)基最好濃度，再分化的培養(yǎng)基的蔗糖濃度在5~6%較適宜（王子霞，2001）。
3.預(yù)處理的影響
日前，低溫預(yù)處理已成為一項(xiàng)廣為采用的提高花藥誘導(dǎo)率的措施。低溫處理時(shí)間視使用的溫度而定。較低的溫度處理時(shí)間短，較高的溫度處理時(shí)間長。典型的玉米花藥處理時(shí)間為4~14℃處理7~14d(Nitsch等,1982;Genovesi和Collins,1982;Dieu和Beck2ert,1986,Tsay等,1986)。
4.培養(yǎng)條件
4.1光照
離體花藥對(duì)光照的反應(yīng)是不同的。一般認(rèn)為,花藥培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行暗培養(yǎng)或給以散射光處理比較好。在分化培養(yǎng)期間，在光強(qiáng)為2000Lx，每天光照10個(gè)小時(shí)為宜。
4.2溫度
培養(yǎng)條件中最主要的是溫度。離體花藥對(duì)溫度比較敏感,是誘導(dǎo)小孢子發(fā)育的關(guān)鍵因素。研究表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)適宜的溫度范圍在25~28℃，分化培養(yǎng)的適宜溫度范圍在23~26℃。
4.3接種密度
由于花藥在培養(yǎng)基上存在營養(yǎng)競爭關(guān)系,呼吸代謝等相互作用,因此，接種密度直接影響愈傷組織的誘導(dǎo)頻率和發(fā)育。玉米花藥培養(yǎng)中，每支試管接種30~50枚花藥的接種密度較為合適。
三、花藥培養(yǎng)在育種中應(yīng)用
1.種質(zhì)材料創(chuàng)新
利用花藥培養(yǎng)可以克服遠(yuǎn)緣雜交的困難。遠(yuǎn)緣雜交作為一種育種手段，能引入不同種、屬的有用基因，為改良現(xiàn)有品種提供了一條重要的途徑。然而在遠(yuǎn)緣雜交過程中，卻存在著雜交不易成功、雜種一代不育或育性低和雜種后代性狀分離幅度大或“瘋狂”分離，時(shí)間長，不易穩(wěn)定三大困難。通過花藥培養(yǎng)，雖然不能解決上述第一困難，但能克服第二、第三種困難。在遠(yuǎn)緣雜種的花粉中也有少數(shù)有發(fā)育能力，或者早期是正常的，這可以通過花藥培養(yǎng)，獲得花粉植株，克服上述二者困難。
2.在誘變育種中的應(yīng)用
花藥培養(yǎng)在誘變育種研究中具有特殊的作用。細(xì)胞誘變篩選育種無疑為育種家提供了一條較為便捷的育種途徑。利用體細(xì)胞進(jìn)行誘變篩選，由于體細(xì)胞中染色體成對(duì)存在，要想使發(fā)生了突變的基因盡快純合并表現(xiàn)出來，還需要經(jīng)過一些自交過程，而利用花藥培養(yǎng)則可以加快誘變突變體的表現(xiàn)進(jìn)程。如胡忠等、莊承紀(jì)等對(duì)水稻離體花藥及其花粉植株進(jìn)行化學(xué)誘變或輻射誘變,獲得了早熟、矮桿突變系。花藥培養(yǎng)中獲得變異體的頻率較高,目前在應(yīng)用各種選擇壓進(jìn)行誘變并篩選抗寒、抗鹽堿等變異系方面, 都有良好的進(jìn)展。如鄭祖玲等用稻瘟病病原菌粗提毒素作為選擇壓,將不抗稻瘟病的水稻品種花寒早、桂農(nóng)12等的花藥,接種在有稻瘟病生理小種F1、E3粗毒素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得了能抗這2個(gè)稻瘟病生理小種的花粉植株株系;Faedi等在培養(yǎng)Pajaro品種的草莓花藥時(shí)發(fā)現(xiàn),再生植株中存在無性系變異,所獲得的1484株植株中,36株表現(xiàn)高產(chǎn)、大果和低感病性。
3.在抗病育種中的應(yīng)用
花藥培養(yǎng)和抗病育種緊密結(jié)合,導(dǎo)入抗病基因,是培育抗病品種的有效方法之一。由于二倍體花粉植株來源于單倍體,控制病害抗性的基因已經(jīng)純合,抗、感病特性十分明顯,因而就能很快地將符合育種目標(biāo)的抗病株系挑選出來,從而育成抗病品種。聶道泰等在中間偃麥草與小麥雜交的衍生材料中發(fā)現(xiàn)“中5”具有中間偃麥草的高抗黃矮病和對(duì)條銹病免疫的性狀,因而以“中5”為外源抗性基因供體,通過花藥培養(yǎng),快速創(chuàng)制出穩(wěn)定的小麥條銹病和黃矮病抗性新種質(zhì)；野生稻ST221抗稻瘟病、感白葉枯病,RBB16則抗白葉枯病、感稻瘟病,而普通栽培稻對(duì)2種病都不抗,龐漢華等通過栽培稻與野生稻雜交、花粉植株培養(yǎng),培育出綜合了野生稻親本抗性的野栽稻雜交后代。應(yīng)用同樣的方法,還可將其它的抗性基因?qū)氲絻?yōu)良品種中去。
4.在轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用
將目的基因轉(zhuǎn)入單倍體材料,更容易鑒定和篩選具有外源基因的材料。小孢子作為外源基因的受體,可以通過離體培養(yǎng)直接獲得純合的轉(zhuǎn)基因材料,使目的基因易于表達(dá)。與常規(guī)育種、分子育種相結(jié)合,拓寬花培育種的應(yīng)用領(lǐng)域。把分子標(biāo)記輔助育種與花培技術(shù)緊密結(jié)合起來,既可以顯著提高培養(yǎng)效率,快速純合植物基因型,盡快獲得純合轉(zhuǎn)基因植物,同時(shí)也擴(kuò)大了花培技術(shù)的應(yīng)用范疇。
四、存在問題
植物花藥培養(yǎng)研究取得了很大進(jìn)展,但是在實(shí)際應(yīng)用和擴(kuò)大花藥培養(yǎng)的基因型范圍方面,還有許多工作要做。
1.誘導(dǎo)頻率和分化成苗率低
對(duì)于多數(shù)植物來講,能形成有活力胚的花藥百分率很低。通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時(shí)沒有生長和發(fā)育跡象,或剛開始生長便導(dǎo)致胚敗育,大量畸形胚狀體出現(xiàn),愈傷組織分化能力低,白化苗難以避免，因此，難以獲得足夠的選擇群體而嚴(yán)重限制了該技術(shù)在育種實(shí)踐中的應(yīng)用。因此,大幅度提高玉米花藥培養(yǎng)效率,獲得大量的加倍純系,是目前玉米花藥培養(yǎng)育種中急需解決的問題。
2.培養(yǎng)方法沒有達(dá)到普遍的最優(yōu)化
培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件間相互作用關(guān)系不清楚，胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率較低，不定芽生長能力差，結(jié)果造成成苗率低，植物再生周期長，白化苗增多等，這些尚有待進(jìn)一步深入研究，以建立玉米花藥培養(yǎng)的最適體系。
3.花藥培養(yǎng)易受到體細(xì)胞的干擾
在花藥培養(yǎng)過程中，花藥壁、絨氈層組織會(huì)不可避免地通過愈傷組織階段形成胚狀體。目前主要通過提高蔗糖濃度，減少或不用2，4-D來誘導(dǎo)花粉愈傷組織，而采用NAA和6-BA配合使用來避免體細(xì)胞對(duì)花藥培養(yǎng)的干擾，但對(duì)一些植物種類效果不明顯，沒有從根本上解決問題，這給染色體倍性鑒定帶來了麻煩，所以如何有效的控制體細(xì)胞干擾，需要進(jìn)一步的研究。
總之，花藥培養(yǎng)技術(shù)是迄今為止創(chuàng)造純合基因型的最有效手段之一，加強(qiáng)花藥培養(yǎng)體系中關(guān)鍵技術(shù)和遺傳機(jī)理的研究，使花藥培養(yǎng)與基因工程相結(jié)合，解決花藥培養(yǎng)對(duì)基因的依賴性，提高花藥培養(yǎng)效率，將為花藥培養(yǎng)的應(yīng)用開創(chuàng)一個(gè)新的局面。
參考文獻(xiàn)：
周旭紅,莫錫君,吳旻,桂敏.2007.花藥培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),19(8):74~76.
王啟柏，宋建成，王守義，郭鳳法.2002.糯玉米新品種山農(nóng)花糯1號(hào)的選育與利用[J].玉米科學(xué)，10（增刊）：16~17.
郭奕明，楊映根，郭仲琛.2001.玉米花藥培養(yǎng)和單倍體育種的研究新進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),
18(1):23~30.
王偉光,高亦珂.2005.花藥培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科版),20(3):280~284
李守嶺，莊南生.2006. 植物花藥培養(yǎng)及其影響因素研究進(jìn)展(綜述)[J].亞熱帶植物科學(xué)，35(3):76～80.
林 淦,周建平,劉華俊,王高芳,黃升謀.2007，玉米植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 35(28):8797～8798.
劉鴻艷,鄭成木.2001, 花藥培養(yǎng)育種研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué).89(1):61~65.
王子霞,楊克銳,海熱古力,顧愛星.2001.玉米花藥培養(yǎng)的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)38(6):346~347.
中國科學(xué)院遺傳研究所組織培養(yǎng)，遺傳學(xué)報(bào)，1975,2（2）：138~142.
廣西玉米研究所等，花藥培養(yǎng)學(xué)術(shù)討論論文集，科學(xué)出版社，1977,211~213.
盧 峰,呂香玲.2006.生物技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用[J]. 雜糧作物.26(2):68~70.
趙延明,董樹亭,張鎖良,丁建國.2007.玉米單倍體育種技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].玉米科學(xué).15(5):60~64.
韋桂旺,程偉東,文仁來,盧衛(wèi)山,閻飛燕,吳茂綱.1998.玉米遺傳基礎(chǔ)材料與愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)系[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),1:3~5.
薩日娜,陳永勝,黃鳳蘭,李國瑞,姚 遠(yuǎn).2008.植物花藥培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2396):650~655.
王延玲,豐 震,趙蘭勇.2006.植物花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),37(1):149~151.
李洪波,關(guān)紅穎.2011.玉米組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè).4:12~14.
王茂良,馮 慧.2010.花藥離體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),25(3):70～74.
杜文平，徐利遠(yuǎn)，余桂容，王 一,鐘昌松.2006.玉米花藥培養(yǎng)影響因素研究[J].玉米科學(xué)，14(6)：104~107.
荊紹凌,孫志超,代玉仙,李淑華.2009.細(xì)胞工程在玉米種質(zhì)改良中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),29(2):19~21.
葉 珍,胡延玉.2000.玉米花培有效技術(shù)初步研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),18(1):21~33.
何雪銀，吳翠榮，田樹云，蘇月貴，覃蘭秋，吳永升，文仁來，謝傳曉.2011.糯玉米、優(yōu)質(zhì)蛋白玉米花培反應(yīng)率的研究初報(bào)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),24(1):10～14.
顏昌敬.1991.農(nóng)作物組織培養(yǎng)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.
關(guān)鍵詞：高級(jí)微生物學(xué)；碩士研究生；教學(xué)改革
中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2016）01-0154-02
研究生的培養(yǎng)不同于本科生，按教育部下發(fā)的《關(guān)于深化研究生教育改革的意見》（教研1號(hào)）所說，培養(yǎng)高層次人才的主要途徑是研究生教育，它是國家創(chuàng)新體系的重要組成部分。該意見要求在研究生學(xué)習(xí)階段，課程學(xué)習(xí)和科學(xué)研究要有機(jī)結(jié)合，強(qiáng)化培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。高級(jí)微生物學(xué)是生物科學(xué)與工程學(xué)院生物工程專業(yè)學(xué)位研究生和微生物學(xué)學(xué)術(shù)型研究生必修的一門課程，是微生物學(xué)理論和實(shí)踐相結(jié)合的一門課程，在研究生的課程中，具有舉足輕重的作用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，新理論、新材料、新方法、新技術(shù)的不斷推廣應(yīng)用，《高級(jí)微生物學(xué)》課程的教學(xué)內(nèi)容也逐步變化，舊的理論、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)方法有些已淘汰，新的已經(jīng)補(bǔ)充。為了使研究生及時(shí)了解本學(xué)科國內(nèi)外的發(fā)展現(xiàn)狀與動(dòng)態(tài)，提高其從事科學(xué)研究、教學(xué)與科技管理、指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐的能力，本教學(xué)團(tuán)隊(duì)在多年的教學(xué)基礎(chǔ)上，對(duì)研究生的“高級(jí)微生物學(xué)”課程進(jìn)行了改革探索。主要針對(duì)教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、考核方式等方面進(jìn)行了改革，努力提高教學(xué)質(zhì)量，積極培養(yǎng)研究生的創(chuàng)新能力。
一、修訂教學(xué)大綱，優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容
江西農(nóng)業(yè)大學(xué)1957年創(chuàng)建了微生物學(xué)科，國內(nèi)知名學(xué)者黃其望、歐陽諒等老前輩創(chuàng)建本學(xué)科。半個(gè)多世紀(jì)歷經(jīng)幾代人的辛勤耕耘，微生物學(xué)科得以發(fā)展壯大。2003年本學(xué)科經(jīng)教育部批準(zhǔn)為碩士點(diǎn)，開始招收微生物學(xué)專業(yè)碩士研究生，而“高級(jí)微生物學(xué)”一直被列為微生物學(xué)專業(yè)碩士研究生的一門重要專業(yè)核心課程，該課程沒有固定教材，講授相關(guān)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展是主要的教學(xué)內(nèi)容，同時(shí)設(shè)定一定學(xué)時(shí)的討論課。隨著研究生擴(kuò)招，研究生掌握的微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)參差不齊。為了使研究生的微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)得以強(qiáng)化，為了拓寬研究生的知識(shí)背景，“高級(jí)微生物學(xué)”課程以周德慶主編的“微生物學(xué)教程”和沈萍主編的“微生物學(xué)”為主要教材，教師講授部分內(nèi)容，學(xué)生自學(xué)部分內(nèi)容。
根據(jù)學(xué)科發(fā)展和進(jìn)步及時(shí)修訂和完善教學(xué)大綱，新的教學(xué)內(nèi)容分幾個(gè)部分：
（1）簡要介紹微生物學(xué)發(fā)展史，微生物研究與發(fā)展現(xiàn)狀，鞏固本科學(xué)習(xí)階段的內(nèi)容，夯實(shí)研究生學(xué)習(xí)高級(jí)微生物學(xué)的基礎(chǔ)；
（2）根據(jù)微生物的特點(diǎn)，沿著微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育、新陳代謝、代謝調(diào)控等基本理論主線，闡述微生物資源開發(fā)利用和學(xué)科的最新成就；
（3）圍繞微生物學(xué)基本技術(shù)和最新的技術(shù)方法，從微生物生態(tài)學(xué)研究與應(yīng)用實(shí)踐，微生物的分類與鑒定兩方面講解。
教師在授課過程中，要盡量結(jié)合科研和生產(chǎn)的實(shí)例，闡明微生物學(xué)現(xiàn)代技術(shù)方法、原理和應(yīng)用，使學(xué)生掌握科學(xué)研究應(yīng)具備的科研思路和常用的微生物學(xué)技術(shù)，引導(dǎo)學(xué)生在科研設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)中去提出問題，分析問題和解決問題。教師在結(jié)合國內(nèi)外微生物學(xué)科的一級(jí)期刊以及Science、Nature等雜志上新近發(fā)表的微生物學(xué)相關(guān)研究成果授課過程中，讓學(xué)生了解微生物學(xué)領(lǐng)域中的源頭創(chuàng)新及科學(xué)效應(yīng)，及時(shí)更新教學(xué)內(nèi)容，使教學(xué)內(nèi)容與時(shí)展保持同步。
二、改革教學(xué)方法，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力
大多數(shù)研究生認(rèn)為研究生學(xué)習(xí)期間關(guān)鍵是要把實(shí)驗(yàn)做好，課程的學(xué)習(xí)不重要，學(xué)習(xí)目的不明確，學(xué)習(xí)態(tài)度不積極，所以經(jīng)常有大量的學(xué)生缺課。有的研究生為了獲取學(xué)分，不是深入探索學(xué)習(xí)相關(guān)知識(shí)，而是通過考試前死記硬背一些考試內(nèi)容過關(guān)。如果老師要求寫文獻(xiàn)綜述，很多學(xué)生為了完成任務(wù)，就在網(wǎng)上收集一些論文資料，不做任何分析，敷衍了事。研究生教育要求學(xué)生不但知識(shí)背景要寬泛，而且要有扎實(shí)的基礎(chǔ)理論和專業(yè)知識(shí)，要達(dá)到這種目的必須是通過課堂教學(xué)而不是通過實(shí)驗(yàn)完成。因此我們?cè)噲D改變教學(xué)方法，提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。我們將理論教學(xué)分解為精講部分、講座部分、自學(xué)討論三個(gè)部分。把以教師為中心變?yōu)橐詫W(xué)生為主體，充分發(fā)揮教師的引導(dǎo)作用和學(xué)生的主觀能動(dòng)作用。首先布置課前文獻(xiàn)報(bào)告，再組織課堂交流，討論文獻(xiàn)相關(guān)問題，最后監(jiān)督討論后的研究報(bào)告和進(jìn)程，把知識(shí)灌輸改變?yōu)橐灾匾暷芰ε囵B(yǎng)為目的的傳授知識(shí)。通過探究式、激發(fā)式教學(xué)方式，提高教學(xué)水平，培養(yǎng)研究生創(chuàng)新能力和創(chuàng)新意識(shí)。
三、開展專題演講，鍛煉學(xué)生綜合能力
完成理論基礎(chǔ)知識(shí)的講解部分內(nèi)容后，給每個(gè)學(xué)生設(shè)立一個(gè)主題，如重金屬的微生物代謝研究進(jìn)展、微生物來源天然產(chǎn)物的生物合成和組合生物合成、微生物代謝組學(xué)、細(xì)菌的信息交流、環(huán)境微生物基因組學(xué)、土壤微生物生態(tài)工程、微生物蛋白組學(xué)、未能培養(yǎng)微生物、新基因發(fā)掘和功能研究、農(nóng)用抗生素的研究等，要求學(xué)生結(jié)合自己將來的研究工作進(jìn)行選題。學(xué)生可利用互聯(lián)網(wǎng)、圖書館查閱文獻(xiàn)資料綜合分析，寫成5000字左右的綜述（不含參考文獻(xiàn)），制作PPT，安排一定的課時(shí)要求學(xué)生輪流上臺(tái)演講，其他學(xué)生和老師作為評(píng)委，根據(jù)其幻燈片制作是否精美、語言表達(dá)是否流暢、內(nèi)容是否條理清晰、回答問題是否恰當(dāng)?shù)戎笜?biāo)為演講的同學(xué)綜合評(píng)分。研究生通過這些新知識(shí)的學(xué)習(xí)，開闊了的學(xué)習(xí)視野，啟發(fā)了思維，強(qiáng)化了學(xué)術(shù)研討和文獻(xiàn)調(diào)研的能力，奠定了科研課題研究工作的基礎(chǔ)。
四、增設(shè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，增強(qiáng)學(xué)生實(shí)踐能力
由于招生規(guī)模逐年擴(kuò)大，研究生生源多樣化明顯。不同的生源掌握的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)差別明顯，新生現(xiàn)狀給研究生教學(xué)提出了新的挑戰(zhàn)。由于是第一學(xué)期開設(shè)高級(jí)微生物學(xué)課程，很多學(xué)生尚未進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，為了培養(yǎng)研究生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和持之以恒的科學(xué)精神。我們?cè)谡n程改革中增設(shè)了實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)安排中，首先設(shè)計(jì)的是一些基礎(chǔ)性的實(shí)驗(yàn)，如，土壤中好氧微生物的分離、純化及無菌操作技術(shù)；細(xì)菌與酵母、放線菌與霉菌的菌落特征識(shí)別；普通光學(xué)顯微鏡的使用與放線菌染色技術(shù)及其形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察。隨后根據(jù)學(xué)生將來的研究方向選題，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，在老師指導(dǎo)下開展實(shí)驗(yàn)。例如微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究方向的研究生，我們確定的題目是“放線菌發(fā)酵培養(yǎng)物對(duì)土壤及植株養(yǎng)分的影響”通過實(shí)驗(yàn)了解不同濃度的鏈霉菌代謝產(chǎn)物處理水稻種子，對(duì)種子萌發(fā)率、可溶性糖、葉綠素含量及根系活力的變化進(jìn)行綜合分析；以稻瘟病菌為病原菌對(duì)三葉一心期的水稻進(jìn)行處理，以觀察鏈霉菌對(duì)水稻幼苗抗病效應(yīng)的影響。通過這個(gè)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，一方面提高了不同生源學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能，另一方面培養(yǎng)了學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性，同時(shí)，學(xué)生的團(tuán)隊(duì)協(xié)作精神也得到了提升。
五、規(guī)范考核模式，強(qiáng)化基礎(chǔ)知識(shí)，考查思維創(chuàng)新
研究生課程考核模式主要有三種，提交課程論文、開卷考試和閉卷考試等。但這些考核方式均存在弊端，如課程論文，學(xué)生只是在網(wǎng)上拷貝現(xiàn)有的論文，不做任何的歸納總結(jié)。開卷考試則是學(xué)生把試卷拿回去，在網(wǎng)上搜索相關(guān)答案直接照搬照抄。閉卷考試時(shí)，學(xué)生就在考試前突擊，死記硬背?？偨Y(jié)經(jīng)驗(yàn)，我們對(duì)高級(jí)微生物課程成績的最終評(píng)定做了許多調(diào)整，量化各項(xiàng)指標(biāo)。我們將考核內(nèi)容設(shè)定為考勤5%+課堂交流25%+課外作業(yè)15%+期末考試55%，考勤考查的是到課率，課堂交流包括課堂問題的交流和由學(xué)生選定的專題演講，課外作業(yè)為布置的每章節(jié)的作業(yè)，期末考試主要是討論型的題型。增加平時(shí)成績和討論分析題型的比例，可以有效避免學(xué)生考前突擊，考后就忘的現(xiàn)象，引導(dǎo)學(xué)生真正地用腦學(xué)習(xí)。
為了順應(yīng)現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，教師不僅要有寬泛的生命科學(xué)理論知識(shí)，而且其技術(shù)知識(shí)層次也要跟上現(xiàn)代生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷更新的步伐。因此我們?cè)谘芯可母呒?jí)微生物學(xué)教學(xué)過程中，隨時(shí)關(guān)注高水平期刊文獻(xiàn)，更新補(bǔ)充知識(shí)，及時(shí)引導(dǎo)學(xué)生密切關(guān)注最新的研究。教師從學(xué)習(xí)者實(shí)踐體會(huì)方面得到寶貴信息和教學(xué)資源，促進(jìn)了知識(shí)結(jié)構(gòu)的不斷更新，提高了教學(xué)水平，有效地實(shí)現(xiàn)了教學(xué)相長。
國內(nèi)許多生物相關(guān)專業(yè)院校都開設(shè)了《高級(jí)微生物學(xué)》課程，各院校在教學(xué)內(nèi)容組織、教學(xué)方法和手段、學(xué)生實(shí)踐等方面各有所長，有許多值得我們學(xué)習(xí)和參考的做法。例如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)充分利用英文原版教材提供的課程網(wǎng)站、各類多媒體技術(shù)等教學(xué)手段，提高教學(xué)信息質(zhì)量，關(guān)注前沿動(dòng)態(tài)和最新科研成果，采用雙語教學(xué)試點(diǎn)部分教學(xué)內(nèi)容、建立網(wǎng)絡(luò)交流平臺(tái)的做法值得我們學(xué)習(xí)。當(dāng)然在進(jìn)行課程改革的過程中，會(huì)遇到一些問題，如在安排課程實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要課時(shí)的保證和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，由此影響了原來的教學(xué)安排，這就需要協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)室和師資安排。我們將進(jìn)一步探討課程改革的可行性，盡可能地完善高級(jí)微生物課程教學(xué)模式，促進(jìn)研究生研究性、自主性學(xué)習(xí)，完善知識(shí)背景和提升研究能力。
參考文獻(xiàn)：
[1]于漢壽，楊冰.研究生高級(jí)微生物學(xué)課程教學(xué)改革與實(shí)踐初探[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（7）：1112-1116.
[2]馬富英，余洪波，張曉昱等.試論研究生高級(jí)微生物學(xué)教學(xué)定位[J].教育前沿：理論版，2009，（3）：24-27.
關(guān)鍵詞：妊娠高血壓疾病 發(fā)病學(xué) 研究進(jìn)展
中圖分類號(hào)：R711 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-7484（2012）10-0222-03
母親安全、兒童優(yōu)先是圍生醫(yī)學(xué)永恒的主題。該主題的初級(jí)目標(biāo)是降低孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡率，中期目標(biāo)是降低母嬰發(fā)病率和殘疾率，終期目標(biāo)是提高人口素質(zhì)[1]。
妊娠期高血壓疾病的發(fā)病學(xué)及機(jī)制的不清目前仍然困擾著全球產(chǎn)科。由該病引起的孕產(chǎn)婦及圍生兒的死亡率和并發(fā)癥也一直威脅著女性健康。由于現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法的進(jìn)步，在研究過程中發(fā)現(xiàn)了很多與妊娠高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的因子，從而建立了許多學(xué)說，本文從以下幾個(gè)方面來綜述：
1 發(fā)病學(xué)研究的概述
盡管妊娠高血壓疾病的病因研究已有100多年的歷史，通過無數(shù)學(xué)者不懈的努力但至今仍未很清楚的闡明。其病理生理學(xué)改變廣泛而復(fù)雜，包括全身血管痙攣、凝血系統(tǒng)的激活及止血機(jī)制異常，前列環(huán)素與血栓素比值的改變等。這些異常的改變導(dǎo)致多器官系統(tǒng)血管的病理損害（如腎、肝、心、腦及子宮胎盤血管床），結(jié)果可引起胎兒生長遲緩、死胎、早產(chǎn)、圍產(chǎn)期窒息，孕婦也容易并發(fā)胎盤早剝、抽搐、顱內(nèi)出血、肺水腫及肝腎功能衰竭等。近年來，隨著醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論特別是分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，使妊娠高血壓疾病從發(fā)病學(xué)的研究到病理生理變化取得了新的突破。
2 發(fā)病學(xué)研究的機(jī)制與學(xué)說
2.1胎盤或滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血學(xué)說：
早在1918年，Young首先提出子宮缺血學(xué)說，其支持理由在于妊娠高血壓疾病多發(fā)生于：（1）子宮內(nèi)壓增高的患者；（2）合并有全身血管病變的孕婦；（3）先天性動(dòng)脈發(fā)育畸形的患者。以后通過許多學(xué)者的實(shí)驗(yàn)證明，子宮—胎盤缺血學(xué)說獲得公認(rèn)。后來又從葡萄胎可并發(fā)妊娠高血壓疾病的現(xiàn)實(shí)得到啟示，胎盤缺血關(guān)鍵可能在于滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血。
滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血與早孕期子宮胎盤血管床發(fā)育受阻有關(guān)。提示早孕期滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺氧，可能是導(dǎo)致子宮胎盤血管床發(fā)育受阻的重要原因。目前又稱這種病理現(xiàn)象為胎盤淺表著床或缺陷胎盤。
2.2高同型半胱氨酸血癥與血管內(nèi)皮損傷學(xué)說：
近年來，動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，高同型半胱氨酸血癥可誘發(fā)孕鼠產(chǎn)生妊娠期高血壓疾病的典型改變[2]。因此，目前高同型半胱氨酸是妊娠期高血壓疾病發(fā)病學(xué)研究的熱點(diǎn)。高同型半胱氨酸可能導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病的機(jī)制：高同型半胱氨酸促進(jìn)氧自由基的生成，使氧化還原系統(tǒng)平衡失調(diào)，呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，繼而引發(fā)小動(dòng)脈痙攣等一系列病理生理改變，符合妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制[3]，動(dòng)物試驗(yàn)通過給予蛋氨酸負(fù)荷至Wistar大鼠形成高同型半胱氨酸動(dòng)物模型顯示，血漿一氧化氮濃度較試驗(yàn)前明顯降低，證實(shí)了高同型半胱氨酸血癥對(duì)血管內(nèi)皮功能的損害作用[4]。高濃度的同型半胱氨酸及其產(chǎn)生的過氧化物超過了細(xì)胞的清除能力，破環(huán)了細(xì)胞的防御性保護(hù)反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血管內(nèi)皮損傷的特殊標(biāo)志物：血管內(nèi)皮損傷因子[5]，血管細(xì)胞粘附因子21，纖維結(jié)合素[6]，均生成增加[7]。研究還表明，早發(fā)型重度子癇前期患者血清同型半胱氨酸顯著高于晚發(fā)型重度子癇前期組及正常妊娠組[8]。所以，研究證明了高同型半胱氨酸在妊娠期高血壓疾病內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起著很重要的作用。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮具有多種重要的生理功能。一旦血管內(nèi)皮受損可導(dǎo)致血管通透性增加，體液與旦白升高，抗凝血因子和血管擴(kuò)張因子減少，在受損部位引發(fā)促凝血因子合成和激活凝血系統(tǒng)，最終導(dǎo)致血小板凝聚及血栓形成并釋放有絲分裂元，其中主要的有血小板衍生生長因子，這是一種很強(qiáng)的血管收縮因子。因此，血管內(nèi)皮損傷是目前提出普遍公認(rèn)的妊娠高血壓疾病的主要發(fā)病機(jī)理。
2.3免疫學(xué)說：
從免疫學(xué)角度看來，胚胎是一半同種異體移植物，妊娠成功有賴于胎兒——母親間的免疫平衡，而這種平衡一旦失調(diào)，就可能引發(fā)排斥反應(yīng)，導(dǎo)致病理妊娠，如妊娠高血壓疾病。目前支持妊娠高血壓疾病與排斥反應(yīng)有關(guān)的證據(jù)主要是，患者子宮螺旋小動(dòng)脈存在著類似于腎移植排斥反應(yīng)所出現(xiàn)的典型的血管炎病變，即螺旋小動(dòng)脈急性粥樣硬化。這一點(diǎn)為過去和近年來國內(nèi)外研究反復(fù)證實(shí)。
2.4遺傳學(xué)說：
從臨床觀察，妊娠高血壓疾病存在著明顯的遺傳傾向，即有妊娠高血壓疾病家族史的孕婦，妊娠高血壓疾病發(fā)病率明顯高于無家族史的孕婦。
從分子學(xué)水平對(duì)本病進(jìn)行探討發(fā)現(xiàn)，采用血清學(xué)方法檢測(cè)，妊娠高血壓疾病患者白細(xì)胞抗原（HRA）DR4頻率明顯增高。PCR和地高辛標(biāo)記寡核苷酸探針雜交技術(shù)，探查H41—DRB1基因座位，也證實(shí)妊娠高血壓疾病HLA—DR4抗原頻率增高和母親、胎兒HLA—DR4抗原相容性增加有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)等位基因0405基因頻率也明顯增加。這些表明，妊娠高血壓疾病至少與HLA—DR4相關(guān)。妊娠高血壓疾病分子遺傳學(xué)的研究，還有待深入。
[關(guān)鍵詞] 半夏曲； 發(fā)酵； 優(yōu)勢(shì)菌種； 16S rDNA和26S rDNA； 系統(tǒng)發(fā)育樹； 菌種鑒定
半夏曲是臨床上常用的中藥炮制品之一，為清半夏、六神曲、生姜汁、面粉、白礬發(fā)酵而成。半夏曲含有酵素等， 具有祛濕化痰、降逆止嘔、健脾溫胃的功能， 用于治療心下痞滿， 不欲飲食， 倦怠乏力， 大便不調(diào)[1]。半夏曲的現(xiàn)代研究側(cè)重處方篩選、化學(xué)成分等，對(duì)于半夏曲炮制中起重要作用的微生物研究甚少。目前，僅蔡清宇等[2]初步表明生半夏曲中含較多雜菌，在血平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)出革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陰性桿菌及球菌，在沙氏培養(yǎng)基中未培養(yǎng)出真菌。本實(shí)驗(yàn)對(duì)半夏曲發(fā)酵炮制過程中不同時(shí)間點(diǎn)的微生物菌群種類和數(shù)量變化進(jìn)行初步研究，并分離鑒定優(yōu)勢(shì)菌種，研究結(jié)果將為揭示半夏曲炮制機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料
1.1 儀器
MILLIQ超純水儀（美國Millipore公司）；培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；PTC200 PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀（美國伯樂公司）；I16K高速低溫離心機(jī) （Sigma公司）。
1.2 試劑
硫酸鏈霉素、瓊脂粉、溶菌酶購自北京索萊寶；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡糖糖瓊脂購自青島海博，酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（自配）；植物基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、酵母菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR master Mix購自北京天根；溶菌酶緩沖液、PCR引物購自上海生工；瓊脂糖購自Innvitrogen公司；DM2000 Marker購自康為世紀(jì)公司。
1.3 供試樣品
半夏曲炮制過程中不同時(shí)間點(diǎn)樣品由成都中醫(yī)藥大學(xué)提供。
1.4 引物
細(xì)菌16S rDNA基因通用引物序列，27F：5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。真菌26S rDNA基因通用引物序列[3]，NL1： 5′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA G3′；NL4： 5′GGTCCGTGTTTCAAGACGG3′。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
2 方法
2.1 半夏曲的制備（由成都中醫(yī)藥大學(xué)制備）
參照中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)。清半夏 160 g、白礬 10 g、 六神曲 5 g、生姜汁20 g、面粉 32 g，除生姜汁、面粉外，其余3味粉成細(xì)粉；生姜汁加水適量，與面粉及上述細(xì)粉攪勻，制成粗粒軟硬適宜的小塊或顆粒，發(fā)酵，干燥。分別取發(fā)酵0，18，36，54，72 h的樣品于無菌的密封袋中4 ℃保存，并在3 d內(nèi)完成不同種微生物的培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
2.2 微生物的培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)
取5個(gè)炮制時(shí)間點(diǎn)的樣品各1 g于無菌的小錐形瓶中，加入9 mL的無菌生理鹽水在水平搖床搖勻，取配好的樣液1 mL加入9 mL的無菌生理鹽水，依次進(jìn)行梯度稀釋為1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，根據(jù)不同取樣點(diǎn)的樣品菌落數(shù)選取合適的3個(gè)稀釋梯度（1×10-1，1×10-2，1×10-3）。取100 μL稀釋液注入平皿固體培養(yǎng)基上，用涂布器涂布均勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。細(xì)菌培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d。霉菌和酵母菌培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d。菌落的計(jì)數(shù)公式：每1 mL原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度3個(gè)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。
2.3 優(yōu)勢(shì)菌種的分離純化
挑選各樣品培養(yǎng)皿中的細(xì)菌、霉菌、酵母菌菌落，取菌落形態(tài)相似且出現(xiàn)頻率多的微生物作為優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行分離純化（盡可能多挑出形態(tài)不同的菌落）及形態(tài)學(xué)觀察。將純化后的單一菌落置于無菌EP管中保藏于4 ℃ 冰箱并盡快進(jìn)行分子生物學(xué)的鑒定。
2.4 優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定
2.4.1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的鑒定 將保存的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌傳代培養(yǎng)，刮取菌苔用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取，采用細(xì)菌16SrDNA的通用引物27F/1492R進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR master Mix 2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取2 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠拍照系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Biodit軟件打開，將測(cè)序結(jié)果復(fù)制于NCBI網(wǎng)站上使用Blast進(jìn)行同源性比較，下載同源性較高的序列采用MEGA 4.0軟件的NeighborJoining方法，1 000 次 Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
2.4.2 優(yōu)勢(shì)真菌的鑒定 將保存的優(yōu)勢(shì)真菌菌株傳代培養(yǎng)，刮取菌苔，分別用酵母菌基因組DNA、植物基因組DNA提取試劑盒提取不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)酵母菌和霉菌的DNA，采用真菌26S rDNA的通用引物NL1/NL4進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR master Mix 2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。其他同2.4.1。
3 結(jié)果與分析
3.1 半夏曲發(fā)酵過程中微生物種類、數(shù)量變化及優(yōu)勢(shì)菌種形態(tài)學(xué)觀察
在半夏曲炮制過程中，從發(fā)酵0 h至發(fā)酵72 h，細(xì)菌數(shù)量少且呈緩慢增長趨勢(shì)；酵母菌在發(fā)酵前期數(shù)量偏少且變化不明顯，發(fā)酵至54 h時(shí)數(shù)量急劇增加，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)1×107.78 CFU?mL-1，在發(fā)酵前期并未出現(xiàn)霉菌，然而發(fā)酵至54 h時(shí)霉菌數(shù)量迅速升高1×106.91 CFU?mL-1，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)與酵母菌數(shù)量相差無幾（表1，圖1）。5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品共挑選出27株優(yōu)勢(shì)菌，其中細(xì)菌11株，酵母菌9株，霉菌7株，菌落顏色為白色和黃色，對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及革蘭氏染色，大多為革蘭氏陽性桿菌；對(duì)優(yōu)勢(shì)酵母菌鏡檢可觀察到明顯的出芽，對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌鏡檢可觀察到菌絲和孢子。
3.2 優(yōu)勢(shì)菌種的分子生物學(xué)鑒定
從半夏曲發(fā)酵過程中的5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)共分出27株優(yōu)勢(shì)菌株，采用16S rDNA，26S rDNA序列分析、相似性比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分別對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、真菌進(jìn)行鑒定。AaX1為Streptomyces sp.（鏈霉屬）；AaX2為Staphylococcus epidermidis（表皮葡萄球菌）；AaX3，DdX2為Bacillus pumilus（短小芽孢桿菌）；AaX4，BbX2，BbX4，EeX1為Bacillus sp.（芽孢桿菌屬）；BbX1，DdX1為B. subtilis（枯草芽孢桿菌）；BbX3為B. aryabhattai（阿氏芽孢桿菌）。AaJ1，AaJ2，AaJ3，BbJ1，BbJ2，DdJ1，DdJ2，DdJ3，DdJ4為Meyerozyma guilliermondii（季也蒙畢赤酵母菌）；375J，375M為Paecilomyces variotii（宛氏擬青霉）；3100J，3100M為Byssochlamys spectabilis（絲衣霉菌）；EeX2，F(xiàn)fX1，F(xiàn)fX3為Aspergillus niger（黑曲霉）（表2，圖2，3）。
4 討論
目前關(guān)于半夏曲發(fā)酵過程中的微生物研究極少，對(duì)于菌種的鑒定也只是粗略的歸類。本文首次研究半夏曲發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)的微生物種類和數(shù)量變化及其優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。研究發(fā)現(xiàn)半夏曲發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量少、變化平緩，而酵母菌和霉菌數(shù)量發(fā)酵至54 h時(shí)迅速增加，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)1×107 CFU?mL-1以上；優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Streptomyces sp.，B. pumilus，B. subtilis，B. aryabhattai以及其他的Bacillus sp.，優(yōu)勢(shì)酵母菌M. guilliermondii，優(yōu)勢(shì)霉菌P. variotii， B. spectabilis， A. niger。結(jié)合菌落計(jì)數(shù)與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，推測(cè)發(fā)酵54， 72 h時(shí)酵母菌的選擇性培養(yǎng)皿上分離出的是霉菌，可能在發(fā)酵前期酵母菌利用面粉中的淀粉質(zhì)迅速繁殖，中后期淀粉質(zhì)減少酵母菌的數(shù)量也逐漸減少。
霉菌在發(fā)酵中能產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)酶以及α淀粉酶，A.niger還能產(chǎn)酸性脂肪酶和有機(jī)酸[45]。A.niger，M.guilliermondii能產(chǎn)生菊粉酶，菊粉酶是一種微生物酶?，F(xiàn)在已知的能產(chǎn)菊粉酶的微生物主要有A.niger，A.ficuum，A.Phoenicis，Pichia sp.，Debaryomyces cantarellii，Athrobacter sp.，Clostridium acetobutylicum[67]。菊粉酶的水解產(chǎn)物低聚果糖是雙歧桿菌的增殖因子，它能抑制有害菌的增長，調(diào)節(jié)胃腸道的功能；降低膽固醇和血脂，改善脂質(zhì)的代謝，促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收以及纖維素的合成等[8]。P.variotii能產(chǎn)木聚糖酶，木聚糖酶能促進(jìn)蛋白酶、淀粉酶等水解酶的釋放，提高發(fā)酵效率，廣泛用于酒類的釀造[910]。Bacillus sp.具有很強(qiáng)的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，它能產(chǎn)生纖維素酶將半夏曲中的植物類原料細(xì)胞的細(xì)胞壁破壞，促使細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來。B.spectabilis在發(fā)酵中的相關(guān)研究較少，對(duì)于其具體的酶學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步的研究。將半夏曲與生半夏、法半夏、姜半夏比較時(shí)發(fā)現(xiàn)只有半夏曲具有消食化積的作用，這可能與半夏曲發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶、淀粉酶、脂肪酶、菊粉酶等有關(guān)。本研究首次對(duì)傳統(tǒng)曲類中藥半夏曲不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行了分離鑒定，為揭示半夏曲的炮制機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[參考文獻(xiàn)]
[1] 張超， 趙重博， 胥敏， 等. 半夏曲炮制歷史沿革及現(xiàn)代研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)――中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2015，17（9）：84.
[2] 蔡清宇， 鄭虎占， 王敏. 4種發(fā)酵法炮制中藥材的微生物初步研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012， 18（6）：119.
[3] 張麗霞， 高文遠(yuǎn)， 王海洋. 六神曲中酵母菌的鑒定[J]. 中國中藥雜志， 2012， 37（13）：1828.
[4] Zheng X W， Tabrizi M R， Nout M J R， et al. DaquA traditional Chinese liquor fermentation starter [J]. J Inst Brew， 2011， 117（1）： 82.
[5] Mahadik N D， Puntambekar U S， Bastawde K B， et al. Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid state fermentation [J]. Process Biochem， 2002， 38（5）： 715.
[6] Viswanathan P， Kulkarni P R. Enhancement of inulinase production by aspergillusniger van teighem [J]. J Appl Bacteriol， 1995， 78（4）： 384.
[7] 陳曉明， 陳寒青， 陳天祥， 等. 菊粉酶的酶學(xué)特性與分子生物學(xué)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2009， 28（5）：577.
[8] 王靜， 金征宇. 微生物菊粉酶的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)， 2002， 12（2）：43.
