發(fā)布時間：2022-07-27 11:09:12
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因工程疫苗樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
很多人在寫論文的時候不知道為什么要寫參考文獻，認為論文的內容才是最重要的，對參考文獻也不是特別重視，參考文獻的寫作對論文來說是有很大的影響的，可以通過它來看出論文的學術研究價值。下面是千里馬小編收集的基因工程論文參考文獻，希望可以給大家?guī)韼椭?/p>
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摘 要：正在研制的口蹄疫新型疫苗有10多種，分別是納米微球黏膜免疫疫苗，表位肽疫苗、口蹄疫O型復合表位蛋白疫苗、A型重組毒株（Re-A/WH/2009）的口蹄疫O型、A型、亞洲Ⅰ型三價滅活疫苗、豬口蹄疫O型廣譜基因工程病毒滅活疫苗、口蹄疫O型標記疫苗、豬O型Mya98毒株空衣殼疫苗、豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）、牛口蹄疫（O型、Asia1型）二價合成肽疫苗、以及口蹄疫病毒活載體疫苗。其中取得突破性進展的有5種，?？谔阋撸∣型、Asia1型）二價合成肽疫苗PD50值大于6.0，免疫持續(xù)期為6個月，保存期為12個月，已完成所有實驗室研究和臨床試驗，申請了新獸藥注冊并已通過初審；豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）PD50值大于6.0，免疫持續(xù)期為6個月，保存期為12個月，已完成所有實驗室研究和臨床試驗，現已申請新獸藥注冊并通過復核試驗和復審；含A型重組毒株（Re-A/WH/2009）的口蹄疫O型、A型、亞洲Ⅰ型三價滅活疫苗PD50值大于6.0，免疫持續(xù)期為6個月，保存期為12個月，獲得了農業(yè)部新獸藥注冊證書，實現了產業(yè)化；豬口蹄疫O型廣譜基因工程病毒滅活疫苗已申報農業(yè)部臨床試驗批文；口蹄疫O型標記疫苗已完成疫苗質量研究，并已申請新獸藥注冊。其他疫苗研究也均取得了程度不等的進展。利用反向遺傳操作技術平臺，獲得基因工程修飾病毒疫苗株5株：（1）rV-STN-5；（2）9O/rV-1；（3）Re-A/WH/2009；（4）Re-Mya/98/BY/2010；（5）Re-Asia1/HN/2006。利用基因克隆、重組等技術，獲得其他基因工程修飾病毒9株，分別為：（1）表達O型FMDV不同亞型主要免疫原性基因的重組偽狂犬病毒1株；（2）共表達O-A-Asia1型FMDV主要免疫原性基因的重組偽狂犬病毒1株；（3）表達FMDV免疫原性基因的桿狀病毒2株；（4）表達豬源IFN-α/IFN-γ和A型FMDV P1基因的重組桿狀病毒3株；（5）表達口蹄疫和小反芻獸疫病毒主要保護性抗原基因的重組羊痘病毒2株。成功研制CpG-IFN、CpG-IL4以及多磷腈和CpG DNA等生物復合佐劑3種，納米乳油佐劑、納米粒IL-2佐劑以及多孔硅和上轉換熒光納米材料的載藥系統(tǒng)等納米復合佐劑材料4種，以及IL-2、IL-4和IFN-γ等多種哺乳動物細胞表達質粒和多糖類免疫增強劑4種。
關鍵詞：口蹄疫 病毒 新型疫苗 基因工程修飾病毒疫苗株 免疫佐劑
Abstract：More than 10 kinds of the new type vaccines is developing. There are 5 kinds of the new vaccine made in major progress. The first one is bivalent synthetic peptide vaccine of FMD type O and type Asia1， the second one is synthetic peptide vaccine in pig of FMD type O（peptide 2600+2700+2800）， the third one is type A recombinant strains （Re-A/WH/2009） of type O、type A and type Asia1 trivalent inactivated vaccine， the fourth one is the marker vaccine of FMD type O， and the last one is broad-spectrum inactivated virus gene engineering vaccine in pig of FMD type O. The first four vaccines were all safe to the animals， PD50 values were greater than 6.0， the vaccine immune duration is 6 months， the shelf life of synthetic peptide vaccine is 12 months， and all has applied for a new veterinary drug registration. The first one has completed all laboratory studies and clinical trials， and has passed the preliminary examination for new veterinary drug application. The second one has completed all laboratory studies and clinical trials， and has passed the inspection test and review. The third one has got the new veterinary drugs registration certificate， and realized industrialization. The last one has applied clinical trial. Varying degrees of progress has been made in other vaccine research. With the reverse genetics technology platform， five genetically engineered vaccine candidate of FMDV were screened and constructed， which were rV-STN-5， O/rV-1， Re-A/WH/2009， Re-Mya/98/BY/2010 and Re-Asia1/HN/2006. Using gene cloning and recombination technology， other nine genetically engineered vaccine candidate of FMDV were constructed， respectively is：（1） PRV TK-/gE-/PanP12A-P1；（2） PRV TK-/gG-/OAY；（3） Two recombinant baculovirus which expressing the immunogenicity gene of FMDV；（4） Three recombinant baculoviruses which expressing interferons alpha/IFNCgamma of porcine and P1 gene of FMDV type A；（5） Two restructuring goatpox viruses which expressing the major protective antigen gene of FMDV and small ruminants virus. Three biological compound adjuvants containing CpG-IFN， CpG-IL4， multi-phosphonitrile and CpG DNA， four nano composite adjuvants including Nano EC adjuvant， nanoparticle adjuvant IL-2， and drug-loaded system of porous silicon and upconversion fluorescence nanomaterials， four mammalian cell expression plasmids which can expressing IL-2， IL-4 and IFN-γ as well as polysaccharides immunopotentiator have successfully developed.
Key Words：Foot and mouth disease virus；New type vaccine；Genetically engineered vaccine candidate；Immunologic adjuvant
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關鍵詞：螃蟹；病害防控；生物防治
1水產病害生物防治技術
這些年，國內水產養(yǎng)殖規(guī)模擴大。但是，一些病毒病、細菌病的感染，嚴重制約水產集約化發(fā)展。而抗生素藥物的濫用，導致這些致病菌源的耐藥性增強，以往的適用藥劑久治難愈。就此，迫切需要一種生態(tài)環(huán)保型的防病措施加以替代。為此，生物技術應用而生，雖然還處于研發(fā)階段，但是很多技術上的優(yōu)勢，讓我們看到了降藥殘、抗耐藥性的曙光。用于水產病害防治的生物技術，主要是借助生物基因重組、反義核酸、反義核酶等技術而改變水產動物的抗病性，以起到降低病害、提高產量、獲得高效益產出的目的。從生物防治的應用效果來看，展現出這些技術優(yōu)勢：減少化學藥劑使用量，降低藥物殘留，節(jié)約生產成本。降低耐藥性，有效抑制致病菌源的擴散蔓延。有利于生態(tài)環(huán)保，為消費者提供綠色、無公害水產品。有利于保護生態(tài)環(huán)境，響應構建生態(tài)環(huán)保社會的響應。
2螃蟹病害影響因素
不同其他水產養(yǎng)殖，螃蟹養(yǎng)殖要獲得高產高效，需要注意的事項更多。這些細節(jié)一旦疏忽，將會造成嚴重的病害威脅。
2.1水質問題
螃蟹生活在水中，對水質的要求更高。尤其池塘中養(yǎng)蟹，水體必須做出處理，否則會為病害感染創(chuàng)造條件。其一，定期組織消毒。消毒常用漂白粉、生石灰，在殺滅致病菌的同時，能確保水體潔凈衛(wèi)生。其二，投放腐殖質肥料。池塘中加適量腐殖質，主要用作肥料。達到水體變青綠色，證實養(yǎng)分充足。
2.2生存環(huán)境
生存環(huán)境除水質，還有居住和活動場所。螃蟹營養(yǎng)儲備源自水中，多數以水草為食源，泥沙僅僅能輔助消化。螃蟹一般居住在較為潮濕的環(huán)境內，對于生長環(huán)境的水質有較高的要求，養(yǎng)殖螃蟹時應對養(yǎng)殖環(huán)境的水質做好清潔工作，布置適量較為茂盛的水草，使螃蟹能夠小范圍的活動，并圍繞著產生很多昆蟲、小魚、小蝦等等，會使螃蟹的生存環(huán)境更加健康，生態(tài)系統(tǒng)更加完善，對避免各種病害效果不錯。
3生物技術在螃蟹養(yǎng)殖病害防治上的應用
3.1基因重組用于增強抗病性
以往螃蟹病害的防治，對消毒劑、抗菌素的依賴較大。此類藥物的頻繁使用，一方面影響水產養(yǎng)殖環(huán)境；另一方面造成病原微生物的耐藥性。為避免此類問題的問題，可嘗試借助病毒蛋白基因重組技術，加載到合適的載體中，而后注射到螃蟹常食用食物中，以增強其抗病體質，確保螃蟹養(yǎng)殖的穩(wěn)定性和安全性。
3.2生物反義技術用于病毒病的控制
螃蟹養(yǎng)殖生產中，病毒病的危害較大，借助水平傳播和垂直傳播，能殃及整個螃蟹池。在病毒病的控制中，生物反義技術的作用顯著。該項技術的作用原理，利用反義核酸技術和反義核酶技術，對病毒原核細胞和真細胞進行基因操作，以抑制病毒的合成和復制，有效控制螃蟹病毒病的傳播。作為一種新型的生物控病技術，其用于螃蟹病毒病的防控功效是不容置否的。但是，還需要不斷的完善，以擴大病毒病防控的應用范圍。
3.3轉基因用于增強免疫力
螃蟹養(yǎng)殖生產期間，在例行消毒、投藥預防等工作時，或多或少在水體中會形成藥物殘留，久之會造成機體的某些病理病變。出于病防重于治的考慮，可借助轉基因技術，提前在螃蟹體內注射特定啟動因子的外源基因，使著病毒反義RNA序列提前得以表達，這樣后期病毒內侵后的復制將受阻，而起到控制病害的目的。自長遠角度考慮，該項技術對螃蟹養(yǎng)殖的病害防控是很有效的，但是當前還沒有得到大面積的推廣應用。
3.4基因工程苗用于預防接種
基因工程運用在螃蟹養(yǎng)殖中防治病害能夠起到良好的作用，因為它能夠幫助螃蟹排除一定的客觀因素的影響，能夠讓水產養(yǎng)殖產品中的螃蟹在生存環(huán)境中可以更好的成長?；蚬こ桃呙绲某霈F，讓螃蟹養(yǎng)殖產業(yè)看到了更多的希望?；蚬こ桃呙鐝募毦筒≡w中提取了具有一定免疫力的基因，然后進行了基因重組，讓疫苗提高了免疫力，在與傳統(tǒng)疫苗的對比中，提高了抗藥性和穩(wěn)定性，能夠提高養(yǎng)殖螃蟹的免疫力，在提高了螃蟹免疫力的基礎上，能夠保證健康與天然?；蚬こ桃呙缒軌驖M足大部分水產養(yǎng)殖戶的需要，能夠發(fā)揮出其作用，并且在技術層面上趨于成熟，能夠批量生產，滿足市場的需要。
關鍵詞：植物葉綠體;基因工程;發(fā)展;應用;存在問題;展望
葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進入子代細胞;1909年baur和correns通過在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質體是母本遺傳的。人們便開始對葉綠體遺傳方面產生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉化了單細胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復光合作用能力,標志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉基因技術,在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。
1葉綠體基因工程概述
1.1葉綠體簡介
葉綠體是植物進行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細胞器,能夠進行自我復制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個反向重復序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。
1.2葉綠體基因組轉化優(yōu)點
葉綠體基因具有分子量小、結構簡單、便于遺傳的特點,故相對于傳統(tǒng)的細胞核遺傳更能高效表達目的基因,這是因為葉綠體基因本身擁有巨大的拷貝數[3]。葉綠體基因可實現外源基因的定點整合,避免位置效應和基因沉默;遺傳表達具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產物對植物的影響小。利用葉綠體基因轉化的這些優(yōu)點,可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時間。
1.3葉綠體轉化的主要過程
葉綠體轉化過程通常分4步:一是轉化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉化體系導入葉綠體;二是將外源表達框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉化的葉綠體細胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉化植物[4]。
1.4葉綠體轉化的主要方法
依據葉綠體轉化的主要過程,生物學家相應地研究若干種葉綠體基因轉化的方法,其中常用的葉綠體轉化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構建完整的質粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對重組葉綠體進行連續(xù)篩選,不斷提高同質化水平,最后獲得所需的轉基因植株[5]。二是農桿菌t-dna介導的遺傳轉化法。將外源目的基因、選擇標記基因等構建到農桿菌的ti質粒上,然后通過與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉化到葉綠體并獲得表達。三是peg處理法。只需將構建好的質粒(含外源基因、標記基因、同源片斷、啟動子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質體共培養(yǎng)。
2葉綠體基因工程的應用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉化為植物所需要的能量,從而轉變?yōu)槿祟愋枰漠a品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費的能量[6]。很多科學家正試圖通過提高rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產高光合效率作物植物的最有價值的方法。
2.2合成有機物質
由于葉綠體型轉基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產物區(qū)域化等優(yōu)點,已被越來越多的人關注,并成為工業(yè)化生產特定有機物質的可靠場所。例如,有科學家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質,是自然界中多種細菌的碳源及能源儲備物。具有生物可降解性,如取代化學合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達盒的葉綠體整合及表達載體,通過基因槍轟擊法轉化煙草。northem點雜交、rt-pcr分析結果表明,葉綠體型轉基因植株中目的基因在轉錄水平的表達明顯高于核轉化植株中相應基因。
2.3生產疫苗
人類治療用蛋白質可以在葉綠體中實現表達,表達效率取決于外源基因的整合位點,增強轉錄和翻譯的調控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經在用葉綠體基因生產疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達,且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經在葉綠體中轉化成功,預示著轉基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進行表達,為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內表達的可行性,他們將基因進行了密碼子優(yōu)化,分別表達了未經改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達量分別為總可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報道bt表達量達46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼sod、apx等酶的基因已經轉入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對環(huán)境脅迫的耐受能力。
2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學上的應用
葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學上的優(yōu)點:一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個較大的數據基礎;二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應用上很有價值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現象;二是雖然有越來越多的葉綠體dna被用作分子標記來研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結合起來獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來面目。
2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景
當今最為普遍的問題就是外源基因從轉基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴散,產生超級雜草或產生和其他作物之間的基因污染,對環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產生的基因逃逸現象的風險遠遠低于核轉化作物,因為大多數作物中的質體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對基因污染的憂慮。
3葉綠體基因工程存在的問題
3.1葉綠體基因轉化在雜合體上的穩(wěn)定性問題
由于高等植物的每個細胞中有10~100個葉綠體,每個葉綠體內有10~100個葉綠體基因組拷貝,因此轉化的葉綠體和未轉化的野生型葉綠體同時存在于轉基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉基因植株易于同質化。
3.2植物的種類有待擴展
可能是由于大多數植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構建的同源重組片段和外源基因的插入位點。目前,已成功轉化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實的植物。
4展望
雖然在葉綠體基因工程領域人們已經取得了一定的進展,但對于改變葉綠體基因工程中所存在的缺點,科學界仍然要有大量的工作需要進行。為此,尋找更多更加合適的方法來改進葉綠體基因工程,使其優(yōu)點更加明顯,必將在未來生物技術領域帶來又一場革命,為人類造福。
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【關鍵詞】 K88；LTB；表達
腸毒素大腸桿菌是引起世界上發(fā)展中國家嬰幼兒及到這些國家旅游者腹瀉的主要致病菌，危害嚴重。現已知大腸桿菌定居因子和腸毒素與疾病密切相關，定居因子是大腸桿菌細胞表面菌毛，腸毒素是大腸桿菌產生的毒性分泌蛋白，有不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素兩種。當病原菌感染宿主后，大腸桿菌首先通過定居因子粘附到小腸粘膜上皮細胞刷狀緣受體上，抵抗住腸道蠕動與腸內分泌物清洗，維持ETEC在腸道內生長繁殖。然后釋放出腸毒素，與小腸細胞膜上的特異受體結合，引發(fā)細胞內水、電解質失衡，造成細胞吸收障礙，產生水樣、脫水性腹瀉。定居因子與小腸粘膜粘附和腸毒素致毒是大腸桿菌腹瀉不可或缺的兩個必要條件。
我們在前人研究工作基礎上，構建了一種能表達大腸桿菌pQE30-K88-LTB融合蛋白的基因工程菌株，并計劃把它轉化到乳酸菌中進行表達，研制大腸桿菌基因工程活疫苗，利用乳酸菌作為載體，經口服途徑進入胃腸道，將大腸桿菌基因表達在活乳酸菌的表面，刺激機體的胃腸道產生粘膜免疫和體液免疫，以期達到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果，為更有效地預防嬰幼兒和旅行者腹瀉，提供一種新型基因工程菌苗的候選菌株。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株與質粒模板菌株和感受態(tài)細胞BL21、表達載體pQE-30，由本實驗室保存；克隆載體pMD18-T, 購自大連寶生物工程有限公司。
1.1.2 主要試劑、酶類限制性內切酶和其它工具酶為MBI公司產品； 弗氏完全(或不完全) 佐劑、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體為Sigma公司產品；其他試劑為國產分析純。
1.1.3 引物設計 根據已發(fā)表的K88和LTB基因設計兩對引物，序列如下：
K88-上游引物：GGATCCTTTGGTAATGTATTGAATG
K88-下游引物：GGTACCTTACTCTTTGAATCTGTC
LTB-上游引物：GGTACCCTCCCCAGACTATTACAGAACTAT
LTB-下游引物：AAGCTTGTTTTTCATACTGATTGCCGC
1.1.4 測序DNA序列由上海生工生物技術服務有限公司測定。
1.2 方法
1.2.1 PCR 擴增
1.2.1.1 DNA模板的制備 用移液器無菌取少量大腸桿菌接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，采用煮沸法制備模板DNA。
1.2.1.2 K88和LTB基因的PCR擴增 PCR反應體系為1μLDNA模板、2μLdNTP、2.5μL PCR緩沖液、上下游引物各1μL、Taq酶0.25μL，混和后加水至總量為25μL；反應的循環(huán)參數為94℃預變性10min；94℃變性1min；56℃退火1min；72℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。
1.2.2 pQE30-K88-LTB表達載體的構建質粒的提取和純化、酶切反應、DN段的分離純化、連接、質粒轉化、菌株誘導表達等，參見分子克隆實驗指南的方法。
1.2.3 蛋白電泳分析參見分子克隆實驗指南。
1.2.4 重組pQE30-K88菌毛蛋白的純化 純化過程按照Qiagen蛋白質純化試劑盒說明書進行。
1.2.5 重組蛋白抗血清的制備將含有純化重組蛋白的緩沖液與弗氏完全(或不完全) 佐劑按照11充分混勻乳化好后, 按照100μg/kg抗原的劑量免疫新西蘭大白兔。首次免疫2周后, 隔周加強免疫。末次免疫后一周, 頸動脈放血, 于4℃冰箱保存, 析出的透明、淡黃色上清液即為K88-LTB融合蛋白的抗血清。
1.2.6 蛋白質印跡分析 分別以K88、LTB單因子血清和自制的重組K88-LTB融合蛋白抗血清作第一抗體, 按1300 稀釋；羊抗鼠抗體作第二抗體,按15 000 稀釋使用。
2 結果
2.1 K88ac基因的擴增結果
圖1: K88、LTB基因PCR擴增結果
1.3 DNA Marker DL2000; 2. K88基因的PCR產物;
4. LTB基因的PCR產物
2.3 重組K88-LTB 融合蛋白基因的表達 將鑒定正確重組質粒pQE30-K88-LTB導入到宿主菌中，誘導處理后, 進行SDS-PAGE分析。結果表明(圖2)，重組K88菌毛蛋白亞基基因獲得高效表達。
圖2 SDS-PAGE電泳結果
1. 加IPTG誘導3h的重組菌;
2. 加IPTG誘導6h的重組菌;
3. 空載體; 4. 蛋白 Marker
2.4重組K88-LTB菌毛蛋白抗血清的免疫學檢測自制的融合蛋白抗血清和K88、LTB單因子血清做一抗分別對重組工程菌株的總蛋白進行蛋白印記檢測。結果表明(圖3),均能檢測到大小約
為31kDa的陽性反應條帶。
圖3 融合蛋白的蛋白印記結果
1,6.蛋白Marker; 2. 陰性血清對照; 3. K88單因子血清為一抗的蛋白印記結果;
4. 重組菌抗血清為一抗的蛋白印記結果; 5.LTB單因子血清為一抗的蛋白印記結果
關鍵詞：雞柔嫩艾美耳球蟲；疫苗；基因重組苗
中圖分類號： S859.797 文獻標識碼： A 文章編號： 1674-0432（2013）-08-82-2
雞球蟲病是由屬于頂復門、孢子蟲綱、真球蟲目、艾美耳科、艾美耳屬的原蟲寄生于雞腸道引起的疾病，由于其造成雛雞大量死亡，耐過的雞只因為消化功能障礙，飼料轉化率下降，生長發(fā)育緩慢而出現生產性能下降問題，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大損失。感染雞的球蟲主要有柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella），堆型艾美耳球蟲（E.acervulina），早熟艾美耳球蟲（E.praecox），巨型艾美耳球蟲（E.maxima），布氏艾美耳球蟲（E.brunetti），毒害艾美耳球蟲（E.necatrix）以及和緩艾美耳球蟲（E.mitis）[1]。其中，柔嫩艾美耳球蟲蟲株是該屬球蟲中毒力最強、危害性最大的蟲種，并且與其他球蟲株之間幾乎無交叉反應，給養(yǎng)雞業(yè)帶來極大的危害，據Allen報道全世界每年因此病造成經濟損失超過80億[2]。
1 重組表達亞單位疫苗
基因重組表達亞單位疫苗是利用DNA重組技術，將編碼E.tenella保護性抗原基因導入受體細菌或者細胞，使其在受體中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈，然后提取保護性抗原肽鏈，加入佐劑即成?；蛑亟M表達亞單位疫苗的候選基因有5401、SO7、3-1E、 MZ5-7和表面抗原SAG5、SAG10、SAG13、SAG 14等。
H. D. Danforth[3]等于1989年開啟了對雞球蟲基因重組表達亞單位疫苗的篇章，他們把柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面抗原5401導入到大腸桿菌中與β-galactosidase 融合表達，添加弗氏完全佐劑配制疫苗，經該重組疫苗皮下免疫一次的雞在攻毒后的損害評分明顯低于對照組，增重效率則明顯高于對照組。Du Aifang [4]等，使用編碼艾美耳球蟲5401抗原轉入到致弱沙門氏菌中制備的重組疫苗，試驗表明最多有55%的保護力。
SO7是位于子孢子折光體上的一種抗原。M. S. Crane[5]等的研究發(fā)現重組表達的E. tenella SO7抗原免疫雞只，不但能保護受到同源株攻毒的雞，同樣也能保護受到E. acervulina， E. maxima 和 E. necatrix攻毒的雞。Christian Klotz[6]等， 用SO7抗原與兩種不同的真核表達載體構成的重組疫苗，做免疫保護性試驗，均能夠減少排卵量，具有部分保護力，而且對其他球蟲也有一定的交叉保護，說明SO7抗原可以作為候選疫苗。
麥博等[7]將E.tenella表面抗原SAG10做原核表達后將重組蛋白以lOOug/只肌肉注射免疫雛雞，攻蟲后觀察免疫效果，免疫組抗球蟲指數為152.13。說明重組表達的EtSAGl0可誘導雛雞產生一定的抗球蟲免疫保護。E.tenella表面抗原SAG13和SAG14[8]，SAG2和SAG7[9] SAG5[10]做原核表達，將可溶性蛋白免疫雛雞，攻毒后檢測其重組蛋白的免疫保護效果，結果表明，這些重組表達蛋白均有一定的抗球蟲保護力。
Millter[11]等于1989年用抗Etenella子抱子28KD的單抗Mabl209從cDNA文庫中篩選出GX3262基因，表達的融合蛋白分子量為115kDa，試驗表明用該重組抗原免疫幼齡肉雞對感染艾美耳球蟲卵囊產生明顯的部分保護作用。
B. M. Subramanian[12]等的研究發(fā)現一個來自于E. tenella 微線體的能激發(fā)宿主雞的體液和細胞免疫反應的抗原EtMIC1，重組表達的EtMIC1能提供受試雞部分的免疫保護。
Ralf.Hosse[13]等首次克隆表達出柔嫩艾美耳球蟲的89kDa親環(huán)蛋白 EtCTP89，在E.tenella整個生活史中表達，其從CsA到Cyps具有緊密聯(lián)系，研究表明親環(huán)蛋白A具有抗球蟲作用。Nishinaka S[14]等從母系的無胸苷激酶活性的R27H1和 R27H4與雞的B細胞系MuH1 和MuH4融合制備單克隆抗體，研究表明能產生IgG。Clarke Lorraine E等克隆EtHL6抗原，該抗原能在Eimeria tenella的子孢子和第二代裂殖子階段表達，結果表明具有一定的保護作用。
2 重組DNA疫苗
重組DNA疫苗是將一種或者幾種抗原基因重組到表達載體，直接或經包裝注入體內表達出相應抗原，誘導機體產生免疫應答。
X. Ding [15]等用E. tenella微線體抗原基因EtMIC-2構建的DNA疫苗載體進行卵內雞胚免疫，結果表明其能提高雛雞攻毒后10天和17天的抗體水平，同時排卵量下降，增重提高。
3-lE是E.tenella子抱子與裂殖生殖階段的表面抗原，氨基酸序列全長1086bp，含有一個由170個氨基酸組成的開放閱讀框架。Song [16]克隆3-lE基因構建 pMPI3-3-lE重組質粒 ，插入到pBK-CMV載體中 ，以不同的免疫劑量和免疫方式免疫1日齡雛雞 ，14日齡時功毒， 10d后，檢測機體的抗體，結果表明不管何種接種方式 ，均能檢測到最高的循環(huán)抗體水平。說明3-lE基因能夠促進機體免疫系統(tǒng)產生免疫保護作用。D. Ma [17]用共表達3-1E和IL-15的DNA疫苗載體免疫試驗雞的結果表明其免疫保護效果（用ACI評價）比僅表達3-1E抗原的DNA疫苗的保護效果更好。Geriletu [18]用共表達E.tenella抗原基因MZ5-7和IL-17的DNA疫苗載體免疫試驗雞，7天后雞脾細胞的IL-2和IFN-γ表達量上升，攻毒后免疫組的抗球蟲指數也明顯高于對照組，而且共表達IL-17的DNA疫苗比僅表達MZ5-7抗原的DNA疫苗的保護效果更好。徐守振[19]增出有3-l E抗原基因和雞IFN基因融合克隆到真核表達載體 proVAX中構建雙價融合表達質粒 proIE。將proIE于14、21日齡免疫AA肉雞，28日齡觀察免疫保護效果。結果顯示， proIE雙價融合DNA疫苗具有增強免疫保護作用，可顯著降低糞便中的卵囊排出量（P
TA4 是柔嫩艾美耳球蟲通過二硫鍵連接5kDa和17kDa兩條多膚形成的子孢子的一種表面糖蛋白。S. Q. Wu[20]的研究發(fā)現表達E.tenella抗原基因TA4的DNA疫苗pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4經肌肉免疫能提供試驗雞部分免疫保護效果，抗球蟲指數（ACI）達到160。Xu Qianming [21]用嵌合有艾美耳球蟲TA4和IL-2基因的聯(lián)合表達疫苗誘導雞體對球蟲病的免疫力，結果表明TA4基因是有效的疫苗表達抗原，該抗原和細胞因子聯(lián)合表達能增強DNA疫苗的免疫力，是一個不錯的方法。
λMZ5-7是在第二代裂殖子階段表達的一種分泌性蛋白（MZP）。秦睿玲[22]將λMZ5-7連接到pVAX載體構建重組質粒pVAX-Mzp5-7，用該重組質粒肌肉注射機體內表達，免疫試驗表明該質粒對雞柔嫩艾美球蟲的攻擊有較好的免疫保護作用。
L Yang [23]克隆廣東株Eimeria tenella的子孢子折光體抗原Etp28基因與AcMNPV-OCC（-））構建重組表達體GST-6xHis-Etp28免疫雞只，實驗表明具有部分保護作用，可以作為候選疫苗。Yang Guilian [24]，用重組雞痘病毒表達艾美耳球蟲菱形基因能夠誘導免疫反應，證明有部分保護作用。D.G..J. Breed[25]， 篩選出4段不同的基因片段用于免疫雞只，都能誘導出強烈的T細胞反應，其中有一段分子量是26到30kDa的基因片段，試驗表明能夠極大的減少盲腸病變。Alireza Talebi[26]，用編碼抗原的基因合成多肽疫苗用于預防雞只，分別用Eimeria acervulina 和Eimeria tenella 功毒，結果是能產生很高水平的抗體，細胞內反應具有部分交叉免疫保護作用。
3 展望
從80年代開始研究雞球蟲基因工程疫苗至今，取得了很大的成果。艾美耳球蟲重組疫苗研究表明以這些抗原基因制備的亞單位疫苗和DNA疫苗對雞球蟲攻毒具有一定的免疫保護作用，但所有這些研究中的重組疫苗都還達不理想的保護效果，離臨床應用還有較大距離。艾美爾球蟲的基因工程重組疫苗研究之所以至今未有突破性進展，我們分析主要有三方面的原因：其一，目前對艾美爾球蟲重組疫苗的研究大都是基于偶然發(fā)現的一些單個抗原基因進行的一些試驗性免疫效果研究，缺乏對艾美耳球蟲所有抗原的系統(tǒng)化研究基礎。其二，由于球蟲的生活史比較復雜，球蟲發(fā)育的每一階段都具有免疫原性，對球蟲感染誘發(fā)保護性免疫起關鍵作用的可能不只一種抗原，可能需要多種抗原的共同作用才能誘發(fā)保護性免疫反應。其三，對球蟲感染宿主的機制現在仍然不清楚，這也是制約柔嫩艾美耳球蟲疫苗研究的一大難題。隨著分子生物技術的不斷發(fā)展和對球蟲基因的研究不斷深入，最終能研究出高效的基因重組疫苗。
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1限制酶的作用及影響因素
1.1 作用：切割特定的核苷酸序列
[高考賞析]（2008，全國I）已知某種限制性內切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產生a、b、c、d四種不同長度的DN段。現在多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經該酶切后，這些線性DNA分子最多能產生長度不同的DN段種類數是（ ）
A.3 B.4 C.9 D. 12
【答案】C
【解析】：每一種限制性內切酶切割DNA后會留下特征性的粘性末端，同時一次切割后，會把DNA分割成兩個片段，且不同的內切酶切后的片段不一樣。若在3個酶切點切斷，得到4種長度不同的DN段；若在2個酶切點切斷，得到3種長度不同的DN段；若在1個酶切點切斷，得到2種長度不同的DN段。因此最多能產生4+3+2=9種長度不同的DNA分子。
1.2 作用結果：形成DN段末端
黏性末端：錯位切，切下后的兩端形成一種回文式的單鏈末端。
平末端：平切，在兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個無黏性末端的平口。
[高考賞析]（2008，江蘇）將動物致病菌的抗原基因導入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關的圖和表。
請根據以下圖表回答下列問題。
（1）在采用常規(guī)PCR方法擴增目的基因的過程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內的DNA聚合酶，其最主要的特點是 。
（2）PCR過程中退火（復性）溫度必須根據引物的堿基數量和種類來設定。表1為根據模板設計的兩對引物序列，圖2為引物對與模板結合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？__________。
（3）圖1步驟③所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？ 。
（4）為將外源基因轉入馬鈴薯，圖1步驟⑥轉基因所用的細菌B通常為 。
（5）對符合設計要求的重組質粒T進行酶切，。假設所用的酶均可將識別位點完全切開，請根據圖1中標示的酶切位點和表2所列的識別序列，對以下酶切結果作出判斷。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________種DN斷。
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________種DN斷。
【答案】（1）耐高溫 （2）引物對B （3）否 （4）農桿菌 （5）①2 ②1
【解析】：由圖1―①過程知，用EcoRI酶和AluI酶切割抗原基因DN段會得到XY片段，由圖1―②過程可知，用EcoRI酶和SmaI酶切割質粒產生MN片段。這樣形成的兩個DN段用DNA連接酶形成重組質粒。其中X、M連接處是EcoRI酶切割位點，M、N之間還有一個PstI酶切割位點。如果用EcoRI酶和PstI酶切割重組質粒，將會在兩個切割位點切割產生2種DN段。但若用EcoRI酶切割重組質粒，由于只有一個切割位點，所以只產生一個DN段。
[高考賞析]（2005、天津理綜II 31）限制性內切酶Ⅰ的識別序列和切點是―GGATCC―，限制性內切酶Ⅱ的識別序列和切點是―GATC―。在質粒上有酶Ⅰ的一個切點，在目的基因的兩側各有1個酶Ⅱ的切點。
①請畫出質粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②請畫出目的基因兩側被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來？為什么？
【答案】：
①
②
③、可以連接。因為由兩種限制性內切酶切割后形成的黏性末端是相同的。
【解析】：基因工程中往往用相同的限制性內切酶切割目的基因和運載體，但不同的限制性內切酶所切割出的黏性末端是相同的，也是可以互補配對的。因此，基因工程中有時也采用不同的限制性內切酶切割目的基因和運載體。
1.3 作用實質：使特定部位的兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
1.4 影響因素：限制酶是一類酶，因此其活性受溫度、pH等因素的影響。
[高考賞析]（2007、全國II）下列有關基因工程中限制性內切酶的描述，錯誤的是（ ）
A、一種限制性內切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列
B、限制性內切酶的活性受溫度影響
C、限制性內切酶能識別和切割RNA
D、限制性內切酶可以從原核生物中提取
【答案】：C。
【解析】：由以上分析可知限制性內切酶能識別和切割DNA。
2 限制性內切酶的特異性
限制性內切酶的特異性是指一種限制性內切酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且在特定的切點上切割。一種酶識別切割部位一般具有反向重復序列，即在切割部位一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。
3 限制性內切酶與其它酶的比較
酶的種類 作用
限制性內切酶（限制酶） 將DNA分子的脫氧核苷酸鏈的磷酸二酯鍵切開
DNA聚合酶 按模板有要求將單個脫氧核苷酸連接形成DNA的子鏈，在DNA復制時起作用
DNA連接酶 兩個DN段之間形成磷酸二酯鍵，縫合斷口
關鍵詞：生物技術；制藥；應用
生物技術也可以稱作是生物工程。以現在化的生命科學為主要基礎，綜合各種科學技術，科學原理以及先進的科學手段，按照設計對生物體和生物原料的加工為人類生產出具有重要作用的生物技術產品。生物技術是人們對動植物以及微生物本身的物質加工而成，為人們生產數優(yōu)質的生物技術產品更好的為社會服務?，F代生物制藥技術其中包括現代化生物技術和發(fā)酵技術，生物技術來源于相關的學科和生物學發(fā)展相融合的產物，其中以重組DNA技術為核心主要的基因工程，這之中還包括有生化工程、細胞工程、微生物工程和生物制藥等各個領域。生物技術是綜合許多種現代科學理論與生命科學研究出來的一種高新技術，運用先進的技術手段為我國制藥行業(yè)的研究創(chuàng)造出廣闊的應用前景。
1 發(fā)酵工程制藥
現代的發(fā)酵制藥工程。又可以被稱作微生物工程，是指采用現代的生物技術手段，利用微生物的特定功能，為人類生產出有用的產品，工業(yè)生產的過程直接運用微生物技術。微生物代謝生產的生物技術就是發(fā)酵工程制藥。發(fā)酵工程制藥中含有，抗生素、激素、維生素等相關的生理活性物質。主要的研究對微生物改良和篩選，工藝研究，等處理產品后續(xù)的問題。如今DNA重組技術對微生物菌類的改良有著重要的作用。在20世紀70年代中，基因技術和細胞技術融合等生物技術的不斷發(fā)展，發(fā)酵工業(yè)進入了現代化的工程階段，其中生產的產品有酒精類飲料，還有胰島素、生長激素和抗生素等多種保健藥物。發(fā)酵工程制藥利用微生物生長以及代謝制作中藥，此類制作中藥方式比一般方式都優(yōu)越，可以全面的改善藥性，降低副作用，櫓幸钚猿煞痔峁┬碌姆⒄狗較潁產生新的藥物作用，針對各種適應癥的治療，充分保護中藥成分，避免中藥活性成分遭到破壞，從而做到節(jié)約藥物資源。
2 基因工程制藥
基因工程制藥是指分子水平上基因的操作，根據人類的需求所設計的，按照設計方案創(chuàng)建含有新性狀的生物新品系，并且能使生物新品系穩(wěn)定的遺傳給下一代。基因工程與工程設計運用了相似的方法，具有明顯的理學與工程學的特點。工程制藥通過DNA技術將疾病的蛋白質、酶、核酸等基因藥物轉移到宿主細胞進行表達和繁殖，最終可以獲得相應的治療藥物?？股赝ǔＪ侨梭w的活性因子，主要研究基因的鑒定、克隆導體的構建，導入產物分離純化等問題。基因工程被人們掌握時間并不是很長，但已經多次的取得了實際性的成果和應用價值，基因技術已經成為我國的核心技術，將在制藥方面充分的發(fā)揮重要作用。
3 細胞工程制藥
相關于細胞工程制藥的范圍還沒有確切的說法，細胞工程是根據分子生物學原理，應用了細胞培育技術以及細胞水平進行遺傳操作。細胞工程大體可分為細胞質工程和染色體工程。細胞工程的主要關鍵是運用植物和動物的細胞培養(yǎng)作為藥物生產技術。利用細胞技術對動植物的培養(yǎng)可以生產出人類活性因子，以及單克隆等抗體產品。也可以生產出活性因子疫苗等DNA產品。在地理條件和氣候環(huán)境的影響下植物細胞代謝產物含量仍然很高。系統(tǒng)正在研究培養(yǎng)，人參、三七等制藥用的植物，并對相關的培養(yǎng)條件做出了。分析表明，人參細胞培養(yǎng)物與藥理活性都和普通種植的人參沒有明顯差異。對于某些植物的細胞培養(yǎng)與生產已經達到了商業(yè)化作用。除了對細胞大規(guī)模的培養(yǎng)之外，毛狀根與不定根的培養(yǎng)也很成功。黃氏毛狀根的培養(yǎng)效果與價格與藥物黃氏相似，希臘毛地黃細胞應在褐藻酸欲的固定情況下培養(yǎng)，可將有毒的毛地黃物質轉化成地高辛，運用紫草細胞培養(yǎng)生產紫草寧等根據野生新疆雪蓮的抗炎等作用，相關人員等進行了細胞培養(yǎng)物與天然新疆雪蓮抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理實驗，實驗表明新疆雪蓮細胞培養(yǎng)物，可以成為野生雪蓮的替代品。資源短缺也是比較嚴重的問題，對于資源短缺完全可以利用細胞培養(yǎng)技術對犀角等相關藥用動物器官進行培養(yǎng)，此方式就能解決資源短缺的問題。
4 酶工程制藥
酶工程指的是用酶、細胞，等擁有獨特的催化功能，借助生物技術手段為人類制造出需要的產品。酶學理論與化工技術結合形成的新技術就是沒酶工程?，F如今已經有很多國家都運用了固定化的酶和細胞生產藥品。沒工程技術是現代生物技術的重要部分，固定化酶不僅能合成藥物分子。還能用于對藥物的轉化。我國運用微生物的兩部轉化方法成功的生產出維生素C，酶工程主要研究產藥酶，酶細胞固定化相關的操作條件等。酶工程的應用前景一片光明，發(fā)酵工業(yè)與化學合成工業(yè)發(fā)生了巨大的改變。藥用植物的有效成分來源于植物的次生代謝產物?，F如今已有很多個國家充分的應用固定化細胞與固定化酶進行藥物的生產。
5 結束語
綜上所述，我國的生物技術已經越來越重要，目前生物制藥的研究成果數量日益增長，其技術制藥研究已經不斷的深入各個領域，中藥研制新藥的環(huán)節(jié)也在不斷的介入在新藥研發(fā)中生物技術制藥形式相對比較重要，使生物技術制藥成為了研發(fā)主流。生物技術同時還具有對珍稀傳統(tǒng)藥材的保護同時還能生產出大量的高品質藥材和藥品活性成分，使藥品活性成分的含量有效的提高。合理的應用現代化生物技術，使我國的制藥行業(yè)不斷地取得更大的發(fā)展。
參考文獻
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