發(fā)布時(shí)間：2023-07-19 17:12:01
序言：寫作是分享個(gè)人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因治療的基本策略樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
1基因治療的途徑和常用載體
基因治療技術(shù)，一種新的治療策略在口腔再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用發(fā)展迅速?；蛑委熗ǔ２捎脙煞N途徑，體外間接基因治療(ex vivo)和體內(nèi)直接基因治療(in vivo) [3,6]。無論間接還是直接基因轉(zhuǎn)移都需要借助載體才能將外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞內(nèi)。目前載體系統(tǒng)主要分為病毒和非病毒兩種[3]，常用的病毒載體有腺病毒（AV），腺相關(guān)病毒（AAV），逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV，包括慢病毒載體），單純皰疹病毒（HSV），雜合病毒等[7-9]。非病毒性載體有裸DNA、脂質(zhì)體與脂質(zhì)體復(fù)合物、納米顆粒等[3]。
2基因治療在口腔再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
2.1 頜面骨組織再生：用于治療頜骨缺損的靶基因很多，作用機(jī)制和環(huán)節(jié)不盡相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]應(yīng)用脂質(zhì)體和腺病毒載體分別將BMP-2基因?qū)氪笫蠊撬杌|(zhì)細(xì)胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比較了兩種載體的體外、體內(nèi)成骨能力。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腺病毒組的轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)體組的兩倍。當(dāng)將基因修飾細(xì)胞復(fù)合明膠海綿植入大鼠下頜骨的骨缺損區(qū)，BMP-2可以在體內(nèi)表達(dá)2 周以上，促進(jìn)了下頜骨骨缺損的修復(fù)，其中腺病毒組4周后骨缺損幾乎完全愈合，而脂質(zhì)體組相對(duì)新骨形成速度較慢，6周后骨缺損基本愈合，陰性對(duì)照組8周時(shí)仍未見骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介導(dǎo)的BMP-2轉(zhuǎn)染BMSC細(xì)胞，結(jié)合磷酸三鈣支架材料可以修復(fù)下頜骨的缺損，獲得礦化密度較高的新生骨。Chang等[12]應(yīng)用腺病毒載體攜帶BMP-2，體外修飾BMSC，并植入小型豬的上頜骨缺損區(qū)，實(shí)驗(yàn)組的骨缺損在3個(gè)月后完全修復(fù)，組織學(xué)觀察顯示新生骨為成熟的編織骨且鈣化良好。近期，Ke等[8]應(yīng)用安全性較好的AAV病毒載體介導(dǎo)BMP-2體外修飾BMSC，并將其植入兔子的上頜骨缺損，頜骨缺損的修復(fù)能力顯著提高。Ashinoff等[13]研究通過腺病毒介導(dǎo)的BMP-2 對(duì)大鼠下頜骨牽張成骨的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組在牽張成骨部位新骨形成量顯著增加。
BMP基因治療在促進(jìn)頜骨組織再生中的應(yīng)用非常廣泛，近來也有一些研究報(bào)道了其他治療基因的應(yīng)用，例如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]將腺病毒介導(dǎo)的bFGF基因修飾的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植入兔子下頜骨牽張成骨區(qū)域，可以有效地促進(jìn)更多的新骨形成。Edward等[15]將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Shh修飾的三種細(xì)胞(牙齦纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來源細(xì)胞)復(fù)合I型膠原植入兔的顱骨缺損處，6周后通過X線片、組織學(xué)觀察，骨組織缺損區(qū)域幾乎完全修復(fù)，同時(shí)機(jī)體沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。
頜骨的生長調(diào)控需要多因子的協(xié)同作用，多個(gè)治療基因的聯(lián)合應(yīng)用也取得了一定進(jìn)展。Koh等[16]的研究證實(shí)通過基因治療的同時(shí)表達(dá)兩種成骨因子BMP2和BMP7，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的骨組織再生能力。通過X線片，Micro CT和組織學(xué)切片進(jìn)行檢測，4周后 BMP2和BMP7的聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組，其成骨能力顯著高于單個(gè)基因轉(zhuǎn)染組，表現(xiàn)為顱骨缺損區(qū)域幾乎完全修復(fù)，甚至個(gè)別缺損區(qū)的成骨量更致密，顯著高于陰性對(duì)照組。另外，將促血管生成因子與成骨因子聯(lián)合應(yīng)用，可以更好地協(xié)同促進(jìn)頜骨組織再生。Peng等[17]的研究表明單獨(dú)應(yīng)用VEGF并不能促進(jìn)骨的再生，但是將VEGF和BMP4基因共同修飾MDSC，并與明膠海綿共同植入小鼠的顱骨缺損區(qū)域后，血管新生和新骨形成能力顯著增強(qiáng)。
2.2 顳下頜關(guān)節(jié)組織再生：顳下頜關(guān)節(jié)的組織工程需要促進(jìn)功能性骨和軟骨組織再生，并需要建立適當(dāng)?shù)墓?軟骨交界區(qū)。 Schek等[18-19]將分化的豬軟骨細(xì)胞和Ad.BMP7基因修飾的人牙齦纖維細(xì)胞復(fù)合到生物支架中，并將復(fù)合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后構(gòu)建了一種骨-軟骨組織，包括血管化骨，成熟的軟骨以及清晰的礦化界面。另一項(xiàng)研究進(jìn)展是將基因直接導(dǎo)入下頜髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒載體攜帶B-半乳糖苷酶基因直接體內(nèi)法注射到豚鼠顳下頜關(guān)節(jié)上腔，4周后發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的穩(wěn)定表達(dá)，從而證明了腺病毒介導(dǎo)基因治療顳下頜關(guān)節(jié)疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒載體介導(dǎo)了治療基因VEGF感染了大鼠的髁突組織，體內(nèi)試驗(yàn)證明VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了下頜髁突的軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程。Li等[22]用AAV病毒載體攜帶Vastatin基因，局部注射到顳下頜關(guān)節(jié)后區(qū)，進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)基因不僅表達(dá)在髁突軟骨，而且在關(guān)節(jié)盤和關(guān)節(jié)窩都有持續(xù)的表達(dá)。這些研究為生理性骨-軟骨結(jié)構(gòu)的構(gòu)建以及TMJ局部基因治療的應(yīng)用前景提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
2.3 牙周組織再生：牙周病造成牙周支持組織破壞及牙周附著喪失，是導(dǎo)致牙齒缺失的最主要原因。牙周病治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已經(jīng)破壞的牙周組織再生以形成新附著。牙周組織再生包括因炎癥破壞吸收的硬組織(牙槽骨與牙骨質(zhì))和軟組織(牙周膜與牙齦)。Jin等[23]將攜帶血小板衍生生長因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺損處，結(jié)果顯示，病毒感染組牙槽骨的修復(fù)4倍于對(duì)照組，而牙骨質(zhì)的修復(fù)則6倍于對(duì)照組，提示應(yīng)用PDGF- B 基因治療可以促進(jìn)牙周的修復(fù)潛能。Chang等[24]的進(jìn)一步研究證實(shí)在牙周骨缺損處直接局部注射腺病毒介導(dǎo)的PDGF-B 是安全可靠的，沒有發(fā)現(xiàn)治療引起的機(jī)體不良反應(yīng)。盡管2周內(nèi)在缺損局部可以檢測到病毒載體的DNA, 隨著時(shí)間的推移病毒載體的量逐漸衰減?？梢奝DGF-B基因轉(zhuǎn)染可有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖和缺損的充填，證實(shí)了基因轉(zhuǎn)入牙周細(xì)胞可以為牙周再生提供一個(gè)便捷的途徑。
2.4 牙體組織再生：牙再生的研究是口腔再生醫(yī)學(xué)研究中最為活躍的領(lǐng)域。Rutherford等[25]采用了體外間接基因轉(zhuǎn)染方式，將攜帶BMP-7的腺病毒載體感染培養(yǎng)的成體纖維細(xì)胞，然后將修飾后的細(xì)胞與膠原復(fù)合植入白鼬炎性牙髓組織中，研究發(fā)現(xiàn)BMP-7的基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)了修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。Nakashima等[26-27]用電穿孔（Electroporation）的方法將分化因子（Gdf1）轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的小鼠牙髓細(xì)胞中可以在體外促進(jìn)其向成牙本質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Nakashima等[28]又用超聲波的方法轉(zhuǎn)染Gdf1，發(fā)現(xiàn)它還可以促進(jìn)犬的自體牙髓干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)在犬的模型上修復(fù)性牙本質(zhì)的形成增加，其中管狀牙本質(zhì)的再生最為明顯。可見，通過轉(zhuǎn)染特異性基因和生長因子進(jìn)入成體牙細(xì)胞，為促進(jìn)組織工程牙的形態(tài)發(fā)生提供了新的思路。
3基因治療的前景展望
成功的基因治療必須包括選擇適當(dāng)?shù)闹委熁?、適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)，使其在體內(nèi)獲得安全、持續(xù)和可調(diào)控的表達(dá)?？谇辉偕t(yī)學(xué)領(lǐng)域的基因治療，雖然在動(dòng)物試驗(yàn)上取得了一些初步經(jīng)驗(yàn)，但是離真正的臨床推廣應(yīng)用還有相當(dāng)長的一段距離。將來的研究將著眼于以下幾個(gè)方面：①對(duì)于目的基因，仍需進(jìn)一步明確何種基因或多種基因的聯(lián)合應(yīng)用；②選擇與構(gòu)建一個(gè)安全、高效、可調(diào)控的甚至是具有組織特異性的靶向基因載體仍是基因治療面臨的重要問題；③在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法上仍需決定最佳基因載體或者靶細(xì)胞的數(shù)量、最佳轉(zhuǎn)入體內(nèi)的時(shí)機(jī)，以及減少不良反應(yīng)以達(dá)到最佳治療效果。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)日趨成熟和基因工程研究的深入，相信這些問題在不遠(yuǎn)的將來都會(huì)得到解決。
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RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）所誘發(fā)，高度特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，使基因沉默的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）［1］。RNAi是生物體在進(jìn)化過程中抵御病毒入侵，抑制由轉(zhuǎn)座子移動(dòng)或重復(fù)序列的積累引起的基因組不穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制，另外還是基因表達(dá)調(diào)控的一條重要途徑。小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）是指干涉RNAi過程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21～23核苷酸（nt）的小雙鏈RNA分子，是RNAi發(fā)揮功能的重要中間效能分子。RNAi自從1998年發(fā)現(xiàn)以來，就以其獨(dú)特的優(yōu)勢在功能基因組學(xué)研究中迅速占有一席之地，迄今已成為基因研究中不可或缺的工具之一，并且隨著對(duì)其作用機(jī)制的逐步了解和應(yīng)用技術(shù)的日漸成熟，已開始應(yīng)用于疾病防治等多個(gè)方面。本文就其機(jī)制，主要特征，以及在消化系腫瘤中的研究作一簡單綜述。
1 作用機(jī)制及主要特征
1.1 作用機(jī)制
RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有兩種作用機(jī)制：一種是大于30 nt的長雙鏈RNA（dsRNA）產(chǎn)生的廣泛的、非特異性效應(yīng)。其機(jī)制可能是激活了細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶R和RNA酶L，從而導(dǎo)致了非特異性的細(xì)胞凋亡。另一種是21～23 nt的短雙鏈RNA（siRNA）產(chǎn)生的相對(duì)具體的、特異性效應(yīng)。目前，RNAi在抗病毒及腫瘤中的研究主要集中在siRNA產(chǎn)生的特異性效應(yīng)，故下面主要介紹siRNA的作用機(jī)制。
siRNA的作用機(jī)制目前尚未完全闡明，但已基本達(dá)成共識(shí)，即①dsRNA在細(xì)胞內(nèi)與DICER酶（一種RNAaseIII家族異性識(shí)別dsRNA的酶）結(jié)合，隨即被分割成21～23個(gè)核苷酸的短鏈dsRNA，在這個(gè)過程中需要ATP的參與。②分割下來的短鏈dsRNA即為siRNA，它是RNAi的起始誘導(dǎo)物，與DICER酶形成RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），此時(shí)RISC無活性，隨后，siRNA經(jīng)歷一個(gè)依賴ATP的解雙鏈過程激活RISC［2］。③siRNA特異性地識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并引導(dǎo)RISC結(jié)合mRNA，RISC中的DICER酶將mRNA切割成21～23個(gè)核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，導(dǎo)致不能進(jìn)行翻譯過程，從而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表達(dá)。④新產(chǎn)生的dsRNA（siRNA）可繼續(xù)形成RISC復(fù)合物進(jìn)入新一輪RNAi的循環(huán)，產(chǎn)生正反饋效應(yīng)。這一過程需在RNA依賴RNA聚合酶（RdRP）的條件下進(jìn)行。除上述機(jī)制外，轉(zhuǎn)基因真核生物dsRNA 還可引起相應(yīng)基因的甲基化，促使異常RNA產(chǎn)生，最終導(dǎo)致基因沉默［3，4］。
1.2 主要特征
1.2.1 高度特異性 RNAi嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則，只降解與之同源的基因的RNA，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。
1.2.2 高效性 相對(duì)很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于mRNA的數(shù)量）就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，在哺乳動(dòng)物中雖沒發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效應(yīng)，但在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中只需摩爾級(jí)濃度的 siRNA 即可有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。
1.2.3 可傳遞性和可遺傳性 RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可跨越細(xì)胞的界限，甚至可以傳播至整個(gè)有機(jī)體及子代細(xì)胞。
1.2.4 濃度、時(shí)間雙重依賴性 在一定時(shí)間內(nèi)RNAi的效應(yīng)強(qiáng)度隨siRNA的濃度增高而增強(qiáng)，或濃度一定的情況下，隨著時(shí)間延長，siRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生正反饋效應(yīng)，導(dǎo)致濃度增高，使RNAi效應(yīng)增強(qiáng)。
1.2.5 ATP依賴性 目前研究發(fā)現(xiàn)RNAi中至少有2個(gè)步驟消耗ATP［5］：DICER酶切割dsRNA成為siRNA并使其5′端磷酸化或胞內(nèi)磷酸化酶使導(dǎo)入的siRNA 5′端磷酸化而使其成為有活性的siRNA的過程；RISC活化即siRNA解雙鏈的過程。
2 RNAi在消化系腫瘤治療中的應(yīng)用
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)等均有密切的關(guān)系。因此我們可以針對(duì)這些因素，利用RNAi相關(guān)技術(shù)在不影響正?；蚬δ艿臈l件下抑制突變基因表達(dá)或基因的表達(dá)過量，從而達(dá)到基因治療的目的。另外，腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，當(dāng)單一癌基因的阻斷不能完全抑制或逆轉(zhuǎn)時(shí)，可以設(shè)計(jì)一種針對(duì)同一家族多個(gè)基因的保守序列的siRNA分子，便可以同時(shí)抑制這一家族的多個(gè)基因表達(dá)，且抑制效果互不干擾。
2.1 原癌基因
原癌基因是細(xì)胞基因組內(nèi)正常的組成成分，自然狀態(tài)下無致癌作用，其主要作用是通過編碼生長因子等調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長、分化。原癌基因激活是腫瘤發(fā)生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成為目前研究腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。
2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人類腫瘤中呈活化狀態(tài)最普遍的原癌基因，有數(shù)據(jù)顯示此基因的突變現(xiàn)象存在于30%～50%的腫瘤組織中，在胰腺癌中可高達(dá)85%。Brummelkamp等［6］建立了突變體的表達(dá)系統(tǒng)即pSUPERKrasv12，轉(zhuǎn)染人胰腺癌CAPAN1細(xì)胞系后，觀察到pSUPERKrasv12能顯著降低Krasv12的mRNA表達(dá)水平。構(gòu)建突變體Krasv12的siRNA病毒載體轉(zhuǎn)染CAPAN1細(xì)胞亦能抑制細(xì)胞克隆生長，并阻止裸鼠腫瘤的形成；而對(duì)照組細(xì)胞生長良好并產(chǎn)生克隆，體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)5周內(nèi)均長出腫瘤，因此證明了該siRNA具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長的作用。 同時(shí)，他們采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體RNA系統(tǒng)在體外也成功地抑制了ras基因的表達(dá)。
2.1.2 Fos基因 Fos基因是一個(gè)重要的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基因，其產(chǎn)物Fos蛋白與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。Fra1蛋白是Fos蛋白家族的成員之一，主要在大腸癌Hct116細(xì)胞株和BE細(xì)胞株中表達(dá)。用siRNA 轉(zhuǎn)染fosL基因，然后再轉(zhuǎn)染到BE細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Fra1蛋白對(duì)細(xì)胞的增殖沒什么影響，卻極大地降低了BE細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，大約降低為原來的1/10［7］。
2.2 抑癌基因
由于抑癌基因在細(xì)胞增殖調(diào)控中起重要作用，因此也成為基因治療的重要目標(biāo)之一。p53基因是最早利用RNAi技術(shù)研究的基因之一，人體內(nèi)大約50%腫瘤的發(fā)生是p53基因突變的結(jié)果。p53基因能夠抑制DNA合成及誘導(dǎo)DNA修復(fù)來抑制細(xì)胞生長，使細(xì)胞停滯在G1期。突變型p53失去對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控發(fā)生癌變。Martinez等［8］的報(bào)道中，將H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型p53和突變型p53的RNA表達(dá)型質(zhì)粒，結(jié)果，野生型siRNA明顯抑制野生型p53蛋白的表達(dá)，對(duì)突變型幾乎無效；而突變型siRNA顯著抑制突變型p53蛋白表達(dá)，野生型基因則不受影響。由此證明，RNA序列能特異性地分別抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，并且對(duì)突變型p53的抑制可在一定程度上恢復(fù)野生型基因的表達(dá)和功能。這就為選擇性和個(gè)體化治療腫瘤提供了可能。
2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因
細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于機(jī)體的生長發(fā)育有著舉足輕重的影響。凋亡過程的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有研究表明［9］，將表達(dá)有綠色熒光蛋白(GFP)的BclXLsiRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MGC803，用RTPCR和免疫熒光法檢測BclXL的表達(dá)，48 h后發(fā)現(xiàn)，與siRNA陰性組相比，實(shí)驗(yàn)組GFP明顯減少，BclXL蛋白和BclXL mRNA表達(dá)減少到基準(zhǔn)水平以下，并有自發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，凋亡率達(dá)21.17%。這就說明BclXL特異性siRNA能夠抑制凋亡抑制基因BclXL的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MGC803凋亡。
2.4 其他相關(guān)基因
2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等腫瘤的發(fā)病中起到重要作用，尤其見于彌散型胃癌。有研究表明將核仁蛋白NoL8特異性siRNA轉(zhuǎn)染3種彌漫型胃癌細(xì)胞ST4，MKN45，TMK1，可以有效地降低該基因的表達(dá)，并能誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，可以考慮把Her2作為胃癌基因治療的又一新的靶點(diǎn)［10］。
2.4.2 β連環(huán)蛋白和APC基因 β連環(huán)蛋白和APC基因是WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成分。這些基因的突變可引起β連環(huán)蛋白表達(dá)水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞過度增生，促進(jìn)結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌的發(fā)生。Verma等［11］構(gòu)建了β連環(huán)蛋白的多個(gè)靶區(qū)域，使得蛋白表達(dá)量降低90%。有學(xué)者進(jìn)一步用轉(zhuǎn)染β連環(huán)蛋白siRNA 的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞注射裸鼠，發(fā)現(xiàn)有50%的老鼠存活超過70 d，而對(duì)照組則全部死亡。
2.4.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF） VEGF是體內(nèi)一種重要的促血管生成因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程中均有著極其重要的作用。Zhang等［12］設(shè)計(jì)了針對(duì)鼠VEGF各亞型的siRNA，以DNA為模板在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)小片段雙鏈RNA的形成，干擾結(jié)果均特異性抑制相應(yīng)VEGF的表達(dá)。同時(shí)，Takei等［13］設(shè)計(jì)了針對(duì)人VEGF的siRNA，采用體外合成法得到相應(yīng)的siRNA，將其注入到荷瘤鼠模型的腫塊中。結(jié)果腫瘤組織中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明顯低于對(duì)照組，腫瘤體積亦明顯小于對(duì)照組。徐文華等［14］設(shè)計(jì)兩組針對(duì)VEGFmRNA 的siRNA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞系SGC7901，觀察其細(xì)胞周期的變化。發(fā)現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞增多， S期細(xì)胞減少，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期;并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體。這些結(jié)果無疑將給腫瘤的基因治療提供了新的思考方向。
2.4.4 TGFβ1 TGFβ1是一種多功能生長調(diào)節(jié)因子，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。它可使胃癌細(xì)胞表達(dá)的黏附分子如CD44表達(dá)增多；抑制腹腔內(nèi)淋巴細(xì)胞活性使其無法有效殺傷腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞以及血管生成，同時(shí)可使間皮細(xì)胞變形，腹膜纖維化等。吳濤等［15］利用載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾TGFβ1，發(fā)現(xiàn)TGFβ1蛋白在人胃癌細(xì)胞株SGC7901中下降約65.8%，腹膜間皮細(xì)胞TGFβ1蛋白下降約61.8%。這一結(jié)果有力證明了siRNA能抑制TFBβ1在人胃癌細(xì)胞株SGC7901和腹膜間皮細(xì)胞中的表達(dá)，為今后胃癌腹膜轉(zhuǎn)移靶向治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
2.4.5 埃茲蛋白(Ezrin) Ezrin作為ERM （ezrin radixin moesin)蛋白家族的成員，是一種細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的連接蛋白，其主要功能是參與細(xì)胞的生長和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，接受胞外信號(hào)，使骨架蛋白重新排布，并增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。近來發(fā)現(xiàn)， Ezrin的表達(dá)與大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，如Ezrin表達(dá)水平與黑素瘤的分級(jí)［16］和乳腺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移［17］均呈正相關(guān)。顏歌等［18］采用小干擾RNA 方法抑制腸癌細(xì)胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ezrin mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力下降，穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這預(yù)示Ezrin蛋白有可能成為抑制腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。
2.4.6 多藥耐藥（multidrugresistance，MDR） MDR一直是腫瘤治療的棘手問題之一。研究證實(shí)抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相關(guān)， Guo等［19］應(yīng)用siRNA敲除Runx3基因后發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物耐藥，將攜帶Runx3的真核生物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人類胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901，體外藥敏性分析顯示SGC7901 對(duì)各種化療藥物敏感。進(jìn)一步分析顯示Runx3可以抑制MDR1和MDR相關(guān)蛋白1 (MRP1)啟動(dòng)子的活性， Runx3的高表達(dá)可能通過下調(diào)MDR1，MRP1，Bcl2的表達(dá)，進(jìn)而使胃癌細(xì)胞對(duì)化療敏感。另外，其中的MDR1基因的過度表達(dá)及其基因產(chǎn)物P糖蛋白增加是導(dǎo)致MDR的重要原因之一，Nieth等［20］設(shè)計(jì)了特異的siRNA分別處理胰腺癌EPG85257RDB細(xì)胞和胃癌EPG85181RDB細(xì)胞來抑制MDR1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞的MDR1的mRNA和蛋白表達(dá)量可降低90%以上，癌細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的耐藥作用分別降低了89%和58%。這也提示我們，siRNA介導(dǎo)RNAi技術(shù)為克服腫瘤耐藥問題可能提供新的策略。
2.4.7 保羅樣激酶1（Pololike kinase 1， Plk1） Plk1是絲氨酸-蘇氨酸激酶之一，參與了有絲分裂的不同階段。Jang等［21］檢測發(fā)現(xiàn)280例胃癌患者中Plk1表達(dá)率高達(dá)95％（268/280），用RNAi的方法阻斷Plk1表達(dá)后，癌細(xì)胞的生長明顯受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B的表達(dá)增加，胃癌細(xì)胞堆積于G2/M期，有絲分裂紡錘體形態(tài)異常，染色體分離延遲，胞質(zhì)分裂延遲或者停止，增殖減慢［22，23］。另外，Plk1基因的缺失亦伴隨癌細(xì)胞凋亡的增加，提示Plk1可能成為胃癌基因治療的理想靶點(diǎn)。
3 問題與展望
RNAi這一方興未艾的新技術(shù)，為腫瘤及其他疾病的基因治療提供了新的途徑。但是仍有許多問題亟待解決：①如何在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因RNA轉(zhuǎn)移到所有腫瘤細(xì)胞并穩(wěn)定持久地抑制癌基因表達(dá)；②如何確定21～23 nt左右的核甘酸序列作為siRNA模板的選擇原則；③如何提高載體系統(tǒng)的效率等等?？傊琑NAi技術(shù)作為一種研究的新工具，治療的新手段，隨著對(duì)其機(jī)制的不斷認(rèn)識(shí)和技術(shù)的改進(jìn)，必將在消化系腫瘤的研究及治療中擔(dān)任不可替代的角色，同時(shí)也預(yù)示著后基因組時(shí)代里一個(gè)嶄新的RNA時(shí)代的到來。
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1 ts、ts基因多態(tài)性和腫瘤基因組不穩(wěn)定性
1.1 ts
ts是由兩個(gè)相同亞單位組成的二聚體蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為72kda,是dna 合成的關(guān)鍵酶， 它催化脫氧尿苷酸（dump） 甲基化， 使之轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账幔╠tmp） 。ts 在dna合成與修復(fù)、細(xì)胞增殖與分化中有十分重要的作用,是腫瘤化療藥5fu和甲氨蝶呤等重要靶酶。
1.2 ts基因多態(tài)性
ts基因位于第18號(hào)染色體上(18p11.32),長16kb,主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于atg起始密碼子上游160～180bp，增強(qiáng)子位于起始密碼子atg上游約400bp。基因多態(tài)性是指在正常人群中同一基因位點(diǎn)上存在兩種或兩種以上等位基因，且各等位基因皆具有相當(dāng)高的頻率(頻率大于 1%)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，ts 基因非翻譯區(qū)(untranslated region,utr )中存在多態(tài)性。多態(tài)性可以分為兩類，即長度多態(tài)性 (length polymorphism) 和位點(diǎn)多態(tài)性(site polymorphism)。
1.2.1 ts基因長度多態(tài)性 長度多態(tài)性可分為兩類：一類為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目不同（variable number of tandem repeats,vntrs），如小衛(wèi)星；另一類長度多態(tài)性是基因的某一片段的缺失或插入所致，如微衛(wèi)星。
(1)5′utr串聯(lián)重復(fù)序列不同數(shù)目 啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄過程起始決定部位,對(duì)基因表達(dá)具有不可缺少調(diào)控作用。增強(qiáng)子是增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的dna序列。ts增強(qiáng)子區(qū)存在28bp串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性，根據(jù)vntrs，分為含有重復(fù)2次的為2r、重復(fù)3次的為3r，見圖1。
更多重復(fù)次數(shù)等位基因(4r,5r,9r)出現(xiàn)頻率很少。因此,常見的三種基因型為3r/3r、2r/3r、2r/2r。
(2)ts基因3′utr 多態(tài)性 2000年，ulrich發(fā)現(xiàn)ts mrna 3′utr的1494bp處存在一個(gè) 6 個(gè)堿基缺失/插入多態(tài),形成+6bp/+6bp、+6bp/-6bp、-6bp/-6bp基因型。ulrich通過95名美國白人檢測ts 3′utr基因型分布，可能由于6bp等位基因頻率分布很低而將-6bp等位基因稱為變異型等位基因。而事實(shí)上英國白人、中國人等不少種族-6bp等位基因型占優(yōu)勢。因此我們認(rèn)為將-6bp等位基因稱作變異型等位基因是不確切的［2］。
1.2.2 ts基因位點(diǎn)多態(tài)性 基因位點(diǎn)多態(tài)性是基因組中散在的堿基的不同，包括點(diǎn)突變、單個(gè)堿基的置換(又稱單核苷酸多態(tài)性,snp)、缺失和插入。mandola發(fā)現(xiàn)在5′utr 2r等位基因第一次重復(fù)序列和3r等位基因前兩次重復(fù)序列中均出現(xiàn)usf家族e(cuò)box(cacttg)。3r等位基因第二次重復(fù)序列第12個(gè)核苷酸等處存在gc snp，見圖1 ［1］。因而2r、 3r分別存在2g、2c和3g、3c等位基因型。2r/2r、2r/3g、2r/3c、3g/3g、3g/3c、3c/3c是6 種常見的基因型。snp是人類基因組中最廣泛的多態(tài)性現(xiàn)象，是造成個(gè)體差異的主要的遺傳原因,在目前人類基因組研究中倍受關(guān)注。
1.2.3 ts基因多態(tài)分布頻率存在種族差異 不同種族人群中ts基因多態(tài)分布頻率有很大差別。（1）2r,3r等位基因分布頻率在土耳其人中為42%
圖1 ts基因5′utr串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性［1］
fig 1 the ts gene has a variable number of tandem repeats and single nucleotide polymorphism in the 5'untranslated region
和58%［ 3］，在中國人中分別為18.82%和81.00%，而在非洲人中相同。（2）美國白人ts 3′utr+6bp等位基因分布頻率為71%,中國人華北、華南地區(qū)人群分別為32%和30.9%［4］?；蚨鄳B(tài)分布頻率存在種族差異,顯示了遺傳背景的多樣性和復(fù)雜性,可能是人類在進(jìn)化過程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，對(duì)維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學(xué)意義。
1.3 腫瘤的基因組不穩(wěn)定性
許多腫瘤還以基因組不穩(wěn)定、等位基因不平衡為特征。雜合缺失（loh）是等位基因不平衡的常見形式。loh是指來自父方或母方的一個(gè)等位基因的缺失。抑癌基因失活通常是在一個(gè)等位基因發(fā)生突變后，另一等位基因又發(fā)生loh。kawakami［5］等通過151例直結(jié)腸癌檢測5′utr重復(fù)序列基因型，50例雜合子中有31例發(fā)現(xiàn)2r、3r等位基因的不平衡,即出現(xiàn)loh。雜合性缺失(loh ) 與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(msi)是基因組不穩(wěn)定性的兩個(gè)主要表型特征。抑癌基因缺失是許多腫瘤形成的關(guān)鍵步驟之一；復(fù)制錯(cuò)誤也是不少腫瘤發(fā)生過程重要環(huán)節(jié)，能增加抑癌基因的突變。因而腫瘤組織ts基因分型，還要考慮基因組不穩(wěn)定性等因素。
1.4 ts基因多態(tài)性與ts表達(dá)水平的關(guān)系
ts基因多態(tài)性影響了 ts 基因 mrna 的穩(wěn)定和翻譯效率,導(dǎo)致不同基因型 ts表達(dá)效率不同。因此，ts基因多態(tài)性是ts表達(dá)水平高低及其可能存在亞型的主要影響因素。morganti等［6］通過48例結(jié)直腸癌患者研究顯示3r/3r基因型的癌組織ts mrna表達(dá)水平顯著高于2r/2r、 2r/3r基因型。mandola等對(duì)結(jié)直腸癌患者研究顯示ts3’tur6bp缺失與在體外降低了的tsmrna穩(wěn)定性相關(guān)，與在體內(nèi)瘤內(nèi)較低ts表達(dá)相關(guān)，可能會(huì)提高癌癥患風(fēng)險(xiǎn)；這與+6bp等位基因患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)率低的觀點(diǎn)一致［4］。
但也有部分學(xué)者認(rèn)為，ts基因多態(tài)性與ts表達(dá)水平并不存在相關(guān)性。2001年kawakami［7］發(fā)現(xiàn)ts基因5′utr多態(tài)性與ts mrna的表達(dá)水平無關(guān)。
2 ts、ts基因多態(tài)性與腫瘤關(guān)系
2.1 ts基因多態(tài)性與腫瘤易感性
2.1.1 ts基因多態(tài)性與腫瘤易感性 人群中存在易感個(gè)體是由于一些與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因存在多態(tài)性。因此,不少學(xué)者認(rèn)為，ts 基因多態(tài)性與患癌癥危險(xiǎn)性密切相關(guān)。adleff等［8］報(bào)道3r等位基因與患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)，這可能是3r等位基因?qū)е聇s表達(dá)水平升高，促進(jìn)細(xì)胞過度增殖、逃避衰老和凋亡的緣故。
2.1.2 ts基因多態(tài)性與腫瘤易感因素之間的相互作用 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受遺傳與環(huán)境因素共同作用的多因子疾病,基因基因、基因環(huán)境交互作用在發(fā)病中具有重要影響。(1) 基因基因交互作用。zhengdong zhang等研究顯示:tser 2r和 ts3'utr 6 bp等位基因在中國南方胃癌病因?qū)W中可能起到協(xié)同作用［9］，存在正交互作用。(2) 基因環(huán)境的交互作用。高長明［2］發(fā)現(xiàn)，ts6bp／-6bp基因型與吸煙、飲酒、和不飲茶的生活習(xí)慣在增加胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性中有明顯的協(xié)同作用。（3）葉酸水平影響。人類紅細(xì)胞葉酸水平<140ng/ml或血漿葉酸水平<3ng/ml會(huì)誘發(fā)染色體損傷，增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。ts5’utr 2r等位基因攜帶者，低葉酸攝入患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)顯著升高,兩者之間存在交互作用［10］。根據(jù)ts基因多態(tài)性與腫瘤易感性相關(guān)性，可以在癥狀出現(xiàn)以前作出基因診斷，對(duì)腫瘤的預(yù)測、預(yù)防、早期診斷等具有不可估量的價(jià)值。
2.2 ts與腫瘤化療
ts表達(dá)的調(diào)節(jié)依賴于細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖狀態(tài)。在同步細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞從g0期進(jìn)入到s期，ts活性水平增加約20倍。5fu是通過抑制ts而發(fā)揮其抗癌活性的。5fu進(jìn)入體內(nèi)后,轉(zhuǎn)化為5氟尿嘧啶脫氧核苷(fdump),在輔因子5,10亞甲基四氫葉酸(ch2fh4)的存在下,能和ts結(jié)合形成等價(jià)的三連復(fù)合物tsfdumpch2fh4,影響ts與dump的結(jié)合,抑制了dtmp的合成,使dna合成受限,達(dá)到消滅癌細(xì)胞目的。最近zou k ［11］等用食管癌細(xì)胞株和結(jié)腸癌細(xì)胞株研究報(bào)道,胰島素能通過提高s期細(xì)胞數(shù)量、改變?nèi)B復(fù)合物水平而增強(qiáng)5fu的抗癌作用。
不少學(xué)者認(rèn)為，ts水平與化療療效間存在負(fù)相關(guān)。banerjee等［12］報(bào)道以ts crna轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使ts高表達(dá)，細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)5fu 和fdurd耐藥。以ts反義rna轉(zhuǎn)染dld1細(xì)胞，ts表達(dá)和活力受到明顯抑制，對(duì)5fu敏感性顯著增強(qiáng)［13］。ts基因表達(dá)水平在4.0×10-3以上的患者對(duì)化療通常均不敏感。以上研究表明,ts水平可預(yù)測腫瘤化療療效。
但也有不少學(xué)者不同意這種觀點(diǎn)。derenzini等［14］認(rèn)為化療很大程度上受到腫瘤細(xì)胞動(dòng)力的影響：對(duì)生長迅速的腫瘤效果更好。靶酶ts高表達(dá)腫瘤以5fu為主基礎(chǔ)的化療改善預(yù)后更好。關(guān)于ts與耐藥之間的關(guān)系,盡管各自結(jié)論有所不同,兩者之間相關(guān)性還是得到了大多數(shù)科學(xué)家的認(rèn)同。部分學(xué)者通過ts表達(dá)水平與患者改善預(yù)后并不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而得出否定結(jié)論,忽視了療效預(yù)后受多因素影響的,所以不足以否定ts水平與化療療效間相關(guān)性。
在使用ts抑制劑化療時(shí)，腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)ts蛋白表達(dá)增強(qiáng)，稱為ts誘導(dǎo)。ts誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致ts蛋白表達(dá)過度、催化活性升高，而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。新型ts抑制劑洛拉曲克在ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其對(duì)多種腫瘤具有很好的治療效果，但在短期運(yùn)用后會(huì)誘導(dǎo)ts表達(dá)上調(diào)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)其耐藥。李亦蕾［15］等研究認(rèn)為,降低ts誘導(dǎo)即可降低腫瘤細(xì)胞耐藥性。
2.3 ts基因多態(tài)性與腫瘤化療
遺傳藥理研究發(fā)現(xiàn)，患者對(duì)藥物的敏感性很大程度上取決于病人的遺傳結(jié)構(gòu)組成?；蚨鄳B(tài)性可引起不同個(gè)體在給藥時(shí)的藥理學(xué)及毒理學(xué)產(chǎn)生不同效果，從而引起藥物治療效果的差異。ts 基因 mrna 的穩(wěn)定和翻譯效率存在差異,并可導(dǎo)致不同 ts 基因型腫瘤患者對(duì)5fu為基礎(chǔ)的化療療效不同。因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ts基因型可作為腫瘤治療療效的預(yù)測指標(biāo)。yawata等［16］藥敏研究顯示：2r/2r和2r/3r組細(xì)胞系比3r/3r組對(duì)fudr敏感性更高；2r/2r 、2r/3rc、3rc /3rc組（低ts表達(dá)組）細(xì)胞系對(duì)fudr敏感性比3rg/3rg組（高ts表達(dá)組）更高，表明對(duì)5′utr重復(fù)序列基因分型有助于指導(dǎo)個(gè)體氟尿嘧啶化療。高長明等［17］研究發(fā)現(xiàn)攜帶ts6/6bp和6/+6bp基因型患者化療有效率顯著高于+6/+6bp基因型患者。villafranca f等［18］研究也認(rèn)為ts重復(fù)序列多態(tài)性可作為腫瘤降期的預(yù)測指標(biāo)。ts基因多態(tài)性的研究有可能為化療方案制訂及預(yù)后評(píng)估提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。
2.4 ts及其基因多態(tài)性預(yù)測腫瘤化療療效存在局限性
不少學(xué)者認(rèn)為，ts表達(dá)水平和ts基因型檢測可以預(yù)測腫瘤患者對(duì)化療藥物的敏感性和化療療效。然而有資料顯示，ts的表達(dá)與氟脲嘧啶有效性呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論并不成立。lecomte等［19］對(duì)90例大腸癌研究表明，5′utr多態(tài)性和3′utr多態(tài)性與5fu療效和生存率無關(guān)。
出現(xiàn)這種相反觀點(diǎn)，一方面,可能在實(shí)驗(yàn)過程中,電泳條件的差異和酶切不完全而產(chǎn)生假陰性,影響 ts 基因型的檢測結(jié)果,從而導(dǎo)致結(jié)論不一致;另一方面,影響腫瘤對(duì)5fu的敏感性有多種因素。除檢測了ts,胸苷磷酸化酶(tp)、胸苷激酶(tk)、二氫尿嘧啶脫氫酶(dpd)等與5fu代謝密切相關(guān)的其他酶應(yīng)該檢測而沒有檢測,因而具有一定的局限性。p53、多藥耐藥基因和多藥耐藥相關(guān)基因等多種基因也是化療療效的影響因素。
2.5 ts相關(guān)耐藥逆轉(zhuǎn)
臨床化療失敗重要原因是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑是抗腫瘤藥物研究的重要策略之一。目前逆轉(zhuǎn)ts高表達(dá)耐藥常用的是ecta方案、5fu聯(lián)用甲酰四氫葉酸(lv)或干擾素γ。 ecta方案使用nb1011等酶催化無毒性試劑。該無毒性試劑經(jīng)ts的催化才有毒性,所以對(duì)ts高表達(dá)耐藥癌細(xì)胞殺傷力強(qiáng)，而對(duì)正常細(xì)胞殺傷力弱，對(duì)ts誘導(dǎo)耐藥效果顯著,是一種理想逆轉(zhuǎn)劑。聯(lián)用lv或干擾素γ能降低ts誘導(dǎo)而避免繼發(fā)性耐藥發(fā)生。引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是化療最終途徑,5fu抑制ts,可能通過腫瘤細(xì)胞表面fas受體和fas配體結(jié)合而引導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。這涉及信號(hào)傳導(dǎo)過程，因而有人提出了免疫治療方法。
ts抑制劑化療時(shí)，腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)ts誘導(dǎo)而耐藥。ferguson［21］等設(shè)計(jì)了與tsmrna3'utr互補(bǔ)的反義寡核苷酸，使tsmrna水平被抑制了70%，細(xì)胞增殖被抑制40%以上。兩者聯(lián)合治療可能克服ts上調(diào)所致的耐藥。peters等研究表明，高ts活性引導(dǎo)的腫瘤耐藥，在合并存在高dpd活性時(shí)明顯增強(qiáng)；對(duì)進(jìn)展期結(jié)腸癌，低tsmran／低dpdmrna者使用5fu和亞葉酸鈣，高tsmrna／高dpdmrna者使用草酸鉑及cptⅱ，取得良好的臨床療效［22］。
2.6 基因治療
腫瘤的基因療法特別是自殺基因療法倍受關(guān)注，其原理是將自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，該基因編碼特殊的酶，可將原先無毒性的前藥在腫瘤細(xì)胞中代謝為毒性產(chǎn)物，從而引起這些細(xì)胞自殺。腫瘤自殺基因治療用于臨床，關(guān)鍵是使目的基因在腫瘤細(xì)胞異性表達(dá)，避免導(dǎo)入正常組織細(xì)胞中，保證基因治療安全性。為此，在自殺基因前端接上一個(gè)腫瘤特異性的啟動(dòng)子，可以使自殺基因呈腫瘤特異性表達(dá)。于波等［23］將ts基因啟動(dòng)子、p16基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入耐藥hr8348細(xì)胞研究結(jié)果表明，ts和p16雙啟動(dòng)子可引導(dǎo)tk基因靶向性殺傷5fu耐藥腫瘤細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞，提高自殺基因治療的安全性。黃慧敏等［24］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的rna干擾（rnai)技術(shù)，能夠間接抑制tsmrna的表達(dá)，為高表達(dá)ts的腫瘤基因治療提供了新的思路和手段。
2.7 ts、ts基因多態(tài)性與腫瘤侵襲性和預(yù)后
不少研究顯示，腫瘤ts的表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)， ts的表達(dá)可以作為判斷癌癥患者預(yù)后的指標(biāo)。余之剛等［25］檢測164例胃癌標(biāo)本顯示， ts表達(dá)水平高低與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床病理分期密切相關(guān)。ts高表達(dá)預(yù)示著腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲性，ts基因產(chǎn)物低表達(dá)患者的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均明顯低于高表達(dá)患者。它在dna合成中發(fā)揮作用,過度表達(dá)ts腫瘤細(xì)胞群可能具有優(yōu)勢潛能，高ts表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)可能是細(xì)胞增生狀態(tài)的反映。也有學(xué)者研究得出不同結(jié)論，董稚明等［26］通過51例食管癌標(biāo)本ts表達(dá)檢測結(jié)果表明，ts表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期無關(guān)。
腫瘤病變的分子特征決定了腫瘤的惡性特征、轉(zhuǎn)移特征、復(fù)發(fā)特征，是腫瘤的預(yù)后判斷的基本依據(jù)。董稚明等［26］研究提示，ts 5'utr多態(tài)性分析可能作為預(yù)測食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的分子指標(biāo)?？梢娙巳夯蛐涂赡芘c腫瘤分級(jí)、分期有關(guān)，對(duì)預(yù)測腫瘤預(yù)后有一定意義；對(duì)腫瘤進(jìn)行分子分型,可能會(huì)使醫(yī)生對(duì)病情和發(fā)展趨勢的預(yù)后判斷更細(xì)致、更正確，對(duì)療效監(jiān)控情況更清晰。
3 結(jié)束語與展望
化療在腫瘤綜合治療中有著重要的價(jià)值，耐藥仍是腫瘤化療一大難題。不同學(xué)者報(bào)道結(jié)論有所不同，這可能由于隨著研究人群、年齡、地域、觀察終點(diǎn)和方法不同而有所差異。組織大樣本隨機(jī)對(duì)照研究，系統(tǒng)評(píng)估,進(jìn)一步研究ts及其基因多態(tài)性與腫瘤關(guān)系,將有助揭開腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制。根據(jù)ts、ts基因型檢測指導(dǎo)個(gè)體化療，可提高用藥針對(duì)性和有效性，減少用藥的盲目性及其毒副作用。不少學(xué)者認(rèn)為，ts及其基因型檢測有望成為預(yù)測腫瘤發(fā)生、化療療效評(píng)估、預(yù)后判斷的指標(biāo)，將為腫瘤防治帶來美好前景。未來個(gè)體化醫(yī)學(xué)，相信會(huì)建立在循證醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)上，以基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為依托的個(gè)體化腫瘤綜合診療模式。但目前國內(nèi)外對(duì)ts基因3′utr 多態(tài)性、snp和腫瘤的基因組不穩(wěn)定性報(bào)道不多,對(duì)ts相關(guān)耐藥的逆轉(zhuǎn)和有關(guān)ts基因治療研究甚少，有待進(jìn)一步研究。
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【摘要】 目的 研究Med19基因在胃癌MGC803細(xì)胞中沉默后對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響。方法 應(yīng)用shRNA慢病毒載體感染胃癌MGC803細(xì)胞沉默Med19基因，通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察Med19基因在胃癌細(xì)胞增殖中的作用，并用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證抑制Med19基因?qū)?xì)胞周期的影響。結(jié)果 構(gòu)建的shRNA慢病毒載體感染MGC803細(xì)胞后細(xì)胞增殖能力顯著降低、細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱，同時(shí)，細(xì)胞周期阻滯于G1期。結(jié)論 Med19基因沉默后胃癌細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期均受到顯著影響，提示Med19在腫瘤形成過程中具有重要作用。
【關(guān)鍵詞】 胃癌;Med19;RNAi;增殖;細(xì)胞周期
中介體(Mediator)最早發(fā)現(xiàn)于酵母菌中，是由多個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的生物大分子復(fù)合物，屬于RNA 聚合酶Ⅱ通用轉(zhuǎn)錄裝置的基本組分，在真核生物mRNA 合成的活化和抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)RNA聚合酶Ⅱ活力進(jìn)行調(diào)節(jié)〔1～3〕。哺乳動(dòng)物中介體的亞基組成及其相關(guān)活性已經(jīng)確定，目前已鑒定30余種亞基，其中多數(shù)亞基與酵母的中介體亞基存在廣泛的同源性〔4，5〕。Med19是中介體其中一個(gè)亞單位，又稱為肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(lung cancer metastasis related protein l， LCMR1)。最初由高轉(zhuǎn)移肺癌中克隆得到，已被證實(shí)參與細(xì)胞信號(hào)由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制Med19基因，可引起某些調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞分化和凋亡的基因的表達(dá)發(fā)生改變，提示Med19可能參與細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控〔6〕。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法在胃癌MGC803細(xì)胞中沉默Med19基因，觀察其影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的能力，從而對(duì)Med19基因在胃癌中的功能進(jìn)行驗(yàn)證。
1 材料與方法
1.1 Med19基因shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 靶向Med19基因的siRNA序列3′AAGGTGAAGGAGAAGCTAAGT5′，由上海生工公司合成短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA(shRNA)，重組進(jìn)入慢病毒質(zhì)粒pLVTHM，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并挑選重組克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，測序驗(yàn)證后的shRNA慢病毒載體大量擴(kuò)增，與包裝輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2G共轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞293T，12 h后換液，轉(zhuǎn)染72 h收集細(xì)胞上清，并裂解細(xì)胞，用微孔濾膜過濾除菌，超速離心后棄上清液，用冰PBS溶液重懸病毒沉淀，得到shRNA慢病毒包裝顆粒，有限稀釋法通過熒光觀察標(biāo)定病毒滴度。
1.2 慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默Med19基因的效率驗(yàn)證 pLVTHMsiMed19載體包裝的慢病毒顆粒感染胃癌MGC803細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，通過計(jì)算在白光下細(xì)胞總數(shù)與綠色熒光細(xì)胞的比值，得到GFP的陽性表達(dá)率，可知慢病毒對(duì)MGC803細(xì)胞感染率達(dá)到85%以上。感染后的第5天抽提細(xì)胞總RNA，通過RTPCR法檢測shRNA慢病毒對(duì)Med19 mRNA表達(dá)的抑制作用;同時(shí)裂解細(xì)胞收集總蛋白，Western印跡法驗(yàn)證Med19蛋白水平表達(dá)的變化，確認(rèn)shRNA慢病毒對(duì)Med19基因的阻斷效應(yīng)。
1.3 MTT方法檢測細(xì)胞增殖情況 實(shí)驗(yàn)共分為三組：shRNA慢病毒感染組(shRNA組，靶向Med19基因的shRNA慢病毒)、非特異性的shRNA陰性對(duì)照病毒感染組(NC組，對(duì)照序列shRNA慢病毒)和空白對(duì)照組(C組，MGC803細(xì)胞未作任何處理)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞MGC803細(xì)胞接種于96孔板中，計(jì)數(shù)細(xì)胞每孔2 000個(gè)，每組5個(gè)復(fù)孔，接種5塊復(fù)板。接種第2天加MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，4 h后吸出培養(yǎng)基，加入DMSO 100 μl/孔。5 min后酶標(biāo)儀檢測OD570吸光度值，連續(xù)檢測5 d。每天一塊復(fù)板。根據(jù)MTT讀值繪制細(xì)胞生長曲線。
1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同前，shRNA慢病毒感染后的MGC803細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔200個(gè)細(xì)胞，將接種好的細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途進(jìn)行數(shù)次換液并進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)觀察，連續(xù)觀察14 d。實(shí)驗(yàn)終止前熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行拍照，終止時(shí)用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，多聚甲醛固定細(xì)胞40 min，PBS溶液再次洗滌后用GIEMSA染色液對(duì)細(xì)胞染色10 min，去離子水清洗細(xì)胞3次去除背景，晾干、拍照和計(jì)數(shù)克隆。
1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)分組同前，感染shRNA慢病毒的MGC803細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞固定時(shí)先用胰酶消化，待細(xì)胞呈圓形未脫落時(shí)，完全培養(yǎng)基終止，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，2 000 r/min、5 min收集細(xì)胞，然后邊震蕩邊加入70%的冰冷乙醇1 ml固定細(xì)胞，4℃過夜。冰PBS洗滌細(xì)胞2次后，2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞1 ml冰PBS溶液重懸細(xì)胞沉淀，分別加入PI(1∶40)及RNase(1∶100)，避光冰浴15 min，上機(jī)進(jìn)行流式檢測。
1.6 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用一維方差分析比較顯著性。
2 結(jié) 果
2.1 shRNA慢病毒介導(dǎo)Med19基因沉默效果 采用針對(duì)Med19基因的PCR引物，以βactin為內(nèi)參，進(jìn)行mRNA的定量檢測。shRNA慢病毒感染組(shRNA組)、陰性對(duì)照病毒感染組(NC組)和空白對(duì)照組(C組)mRNA結(jié)果見圖1，mRNA水平基因抑制效率達(dá)到78.4%。同時(shí)，Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果中同樣證實(shí)shRNA組Med19蛋白的表達(dá)量與NC組相比明顯減少，表明shRNA慢病毒感染MGC803細(xì)胞后可以高效抑制Med19蛋白的表達(dá)，見圖1。
圖1 shRNA慢病毒在MGC803細(xì)胞中
對(duì)Med19基因的抑制效率
2.2 shRNA慢病毒介導(dǎo)Med19沉默抑制胃癌MGC803細(xì)胞增殖 在MTT實(shí)驗(yàn)方法中，OD570nm處的吸光值可間接反映出細(xì)胞增殖的情況，即OD570 nm值越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)。MTT法檢測轉(zhuǎn)染后1～5 d各組細(xì)胞的吸光度值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。對(duì)各組細(xì)胞同一檢測點(diǎn)的吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，Med19 shRNA慢病毒感染組MGC803細(xì)胞的570 nm OD值顯著低于其他兩組，表明MED19基因沉默后MGC803細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞活力下降，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組OD570 nm值基本一致，說明慢病毒本身對(duì)MGC803細(xì)胞增殖能力無影響，從而也證實(shí)由于shRNA慢病毒介導(dǎo)了MGC803細(xì)胞中Med19基因的沉默導(dǎo)致了細(xì)胞增殖能力下降，見圖2。
圖2 MGC803細(xì)胞增殖曲線
2.3 Med19基因沉默降低MGC803細(xì)胞克隆形成能力 從單個(gè)克隆看，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目較多且兩組相差不大，而shRNA慢病毒感染的MGC803克隆中細(xì)胞數(shù)比其他兩組顯著減少，見圖3。同時(shí)，克隆計(jì)數(shù)結(jié)果表明，Med19沉默后細(xì)胞克隆數(shù)(42.7±7.1)與陰性對(duì)照組(124.3±22.8)和空白對(duì)照組(147.3±28.5)克隆數(shù)相比顯著降低，表明抑制Med19基因能夠降低胃癌MGC803細(xì)胞克隆形成能力。表1 PI染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果
2.4 Med19基因沉默引起MGC803細(xì)胞周期阻滯于G1期 應(yīng)用PI染色細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)觀察Med19基因沉默后對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞周期的變化。從表1數(shù)據(jù)可以觀察到，與陰性對(duì)照相比，抑制Med19能夠使G1期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少，差異具有顯著性。由此可見Med19基因RNAi后細(xì)胞周期阻滯于G1期，細(xì)胞復(fù)制能力降低，驗(yàn)證了其表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用(圖4)。
圖4 MGC803細(xì)胞周期峰型圖
3 討 論
在世界范圍內(nèi)胃癌死亡率居惡性腫瘤第二位，由于飲食結(jié)構(gòu)等因素影響，目前全球約60%的胃癌新發(fā)病例發(fā)生在中國、日本等東南亞國家。外科手術(shù)是目前胃癌治療的最有效手段，但術(shù)后5 年生存率較低。據(jù)2009年統(tǒng)計(jì)，胃癌病人術(shù)后5年的總體生存率低于25%〔7〕。胃癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)是以癌基因的激活與抑癌基因的失活為基礎(chǔ)的多步驟、多階段效應(yīng)過程，通過這些基因表達(dá)產(chǎn)物的改變，引起細(xì)胞惡性增殖、去分化和侵襲性生長，從而導(dǎo)致癌變過程。從治療策略看，控制癌基因的激活和抑癌基因的失活能夠阻斷腫瘤的發(fā)生。自RNA干擾(RNAi)技術(shù)應(yīng)用以來，其高效性、特異性和低毒性使得該技術(shù)在反向基因組學(xué)、基因治療、抗腫瘤、抗病毒、抗遺傳性疾病以及胚胎干細(xì)胞的研究中顯示了巨大的潛力〔8，9〕。
Med19基因在酵母中又名ROX3 (或SSN7、RMR1等)，最初是在觀察cyc7基因突變時(shí)發(fā)現(xiàn)的〔10〕，研究證實(shí)Med19編碼產(chǎn)物屬于中介體和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亞基〔11〕。Med19/Rox3構(gòu)成了酵母RNA聚合酶Ⅱ的頭部組件〔12，13〕。缺失Med19/Rox3能夠?qū)е轮薪轶w中部組建的解離，僅保留由頭部和尾部模塊組成的亞復(fù)合體，提示Med19可穩(wěn)定中部組件在中介體的位置，而對(duì)頭部和尾部組件無影響。此外，突變的Med19/Rox3中介體對(duì)RNA聚合酶Ⅱ的親和力下降，無法刺激 RNA聚合酶Ⅱ亞基羥基端結(jié)構(gòu)域(Carboxy terminal domain， CTD)的磷酸化〔14〕。最近，Med19和Med26被確定為沉默轉(zhuǎn)錄因子RE1操縱的調(diào)控裝置的重要組分〔15〕。RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子以Med19/Med26為橋梁招募中介體，以使非神經(jīng)元細(xì)胞中的神經(jīng)元特異性基因?qū)崿F(xiàn)表觀遺傳沉默。
Med19在腫瘤中的研究還不完善，但關(guān)于Med19在胃癌組織中的表達(dá)問題已在本人的前期研究中得到證實(shí)和闡述，應(yīng)用免疫組化組化方法檢測Med19在胃癌、癌旁和正常組織中的表達(dá)，證實(shí)Med19在腫瘤組織中的高表達(dá)具有特異性，該基因的表達(dá)上調(diào)可能涉及胃癌癌變的發(fā)生。但是Med19對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響尚未闡明。我們?cè)诔聊琈ed19基因后，通過MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期以及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，結(jié)果顯示RNAi組與對(duì)照組相比， MGC803細(xì)胞的增殖能力顯著降低，克隆形成能力減弱，細(xì)胞，細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期阻滯，但對(duì)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力沒有顯著的影響。本部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了利用RNAi技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞Med19基因，能夠有效地抑制胃癌細(xì)胞的惡性表征，提示在胃癌中靶向基因治療中Med19可能成為有效的靶位點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
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關(guān)鍵詞：人工核酸內(nèi)切酶：基因編輯：CRISPR/Cas9
中圖分類號(hào)：Q789
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0276-07
基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)是研究基因功能的一種重要手段，同時(shí)也是許多基因相關(guān)疾病的潛在治療方法。早期主要依賴于基因同源重組及體細(xì)胞核移植技術(shù)來完成對(duì)特定基因的改造，然而自然情況下基因重組效率極低，且細(xì)胞核移植技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力[1，2]，嚴(yán)重制約了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。因此，在不斷尋求高效、簡便的基因編輯方法過程中，人工核酸內(nèi)切酶（engineered endonuclease.EEN）介導(dǎo)的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)快速發(fā)展成為一種主流方法。
人工核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因編輯的第一步是在修飾位點(diǎn)誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂缺口（doublestrand breaks，DSB）。核酸酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的DSBs可借助非同源末端連接（non homologous end-join-ing，NHEJ）機(jī)制或同源重組（homologous recombi-nation，HR）機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。NHEJ將斷裂的雙鏈末端直接連接起來，可有效地引起基因的插入/缺失突變，即inclel突變，從而使基因的功能遭到破壞。當(dāng)引入模板DNA序列時(shí)，可通過同源重組修復(fù)（HR），插入或刪除特定的基因序列。通過人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的DSBs，基因突變的幾率大于1010，有時(shí)甚至超過50%[3] ，因此，人工核酸內(nèi)切酶被稱為“DNA剪刀”。鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger en-donuclease，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 （Lranscriplion activator-like effector nuclease，TALEN）分別作為第一代和第二代“DNA剪刀”，都是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合而成。但由于這兩種人工核酸內(nèi)切酶制備復(fù)雜，成本昂貴，難于開展大規(guī)?；蚓庉嫷暮Y選，使其應(yīng)用有所局限。近年來，細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR （clustered regularly interspaced shortpalinclromic repeats）的應(yīng)用使得基因組編輯技術(shù)進(jìn)一步簡化.CRISPR/Cas9作為第3代人工核酸內(nèi)切酶迅速成為目前研究的熱點(diǎn)，其獨(dú)特性和靈活性在于該系統(tǒng)是通過RNA介導(dǎo)核酸酶與靶DNA序列結(jié)合的。與以DNA結(jié)合蛋白為基礎(chǔ)的ZFN和TATJFJN相比，以RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理更加簡單，只需要遵循RNA與DNA之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。
本文重點(diǎn)介紹了CRISPR/Cas9的作用機(jī)理及其應(yīng)用，最后就CRISPR/Cas9技術(shù)目前存在的問題及其應(yīng)對(duì)策略進(jìn)行了探討。
1 CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理
CRISPR廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，是細(xì)菌和古細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以介導(dǎo)外源DNA的降解，從而抵御病毒等外來入侵者[4，5]。1987年，日本學(xué)者首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)該間隔重復(fù)序列[6]；2002年，Jansen等[7，8] 將其正式命名為CRISPR，基因編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為CRISPR附屬蛋白（CRISPR-associa七ion pro-teins，Cas）。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有Type I、TypeⅡ、TypeⅢ3種不同類型，其中研究最多、應(yīng)用最廣的是Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。產(chǎn)膿鏈球菌（Strepto-coccus pyogenes SF370）的Ⅱ型CRISPR基因座主要由三部分組成，包括Cas9核酸酶基因、不編碼蛋白質(zhì)的tracr RNA基因和CRISPR基因（圖1），其中CRISPR基因由前導(dǎo)序列（leader sequence）、間隔序列（ spacers）和重復(fù)序列（repeats）組成[9] 。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫主要分為3個(gè)步驟。首先是新的間隔序列的獲取：外來質(zhì)?；虿《綝NA首次入侵時(shí)，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)將外來DNA整合入CRISPR重復(fù)序列之間形成一段新的間隔序列，并隨著宿主DNA -起編碼；其次是crRNA的表達(dá)、加工與成熟：CRISPR重復(fù)序列和間隔序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工為pre-crRNA，tracrRNAs與pre-crRNA的重復(fù)序列區(qū)域配對(duì)雜交，然后內(nèi)源性的RNaseⅢ從每一個(gè)間隔序列的5'端裂解雜合的pre -crRNA -tracrRNAs，產(chǎn)生成熟的tracr-RNA-crRNAs，并與Cas9核酸酶結(jié)合[10] ；最后，當(dāng)同樣的外源DNA再次出現(xiàn)時(shí)，CRISPR-Cas復(fù)合體可與雙鏈DNA的靶位點(diǎn)結(jié)合并切割雙鏈。靶標(biāo)的識(shí)別和DNA鏈的裂解既需要間隔序列和靶序列之間的互補(bǔ)，又需要靶DNA序列3'端存在PAM （Protospacer adjacent motif）序列[11]，PAM序列的存在還避免了CRISPR基因本身被作為靶標(biāo)識(shí)別，提供了一個(gè)識(shí)別“自己”和“異己”的機(jī)制。不同的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)有不同的PAM序列，基于產(chǎn)膿鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的PAM序列為NGG，N指的是任意核苷酸[10] 。
Cas9實(shí)際上是一種核酸酶，它具有兩個(gè)獨(dú)立的核酸酶位點(diǎn)：一是HNH核酸酶位點(diǎn)，可以斷裂與crRNA互補(bǔ)的那條鏈；另一個(gè)是類似于RuvC核酸酶位點(diǎn)，可以裂解另一條非互補(bǔ)鏈。研究[12，13]發(fā)現(xiàn)Cas9家族的所有成員都具有相同的結(jié)構(gòu)核心，這個(gè)結(jié)構(gòu)核心的特征為一種具有兩個(gè)主葉（major lobe）-核酸酶結(jié)構(gòu)域葉和a-螺旋葉的結(jié)構(gòu)，其中核酸酶結(jié)構(gòu)域葉是由HNH結(jié)構(gòu)域、RuvC結(jié)構(gòu)域以及與PAM序列相互作用的C末端結(jié)構(gòu)域組成。這兩個(gè)主葉含有保守性的裂縫，而這些裂縫在核酸結(jié)合中發(fā)揮功能。Cas9蛋白本身以非活性的狀態(tài)存在，它的核酸酶活性被C末端結(jié)構(gòu)域的方向所抑制，而且不能與DNA結(jié)合；但當(dāng)其與crRNA-tracrRNA復(fù)合體結(jié)合時(shí)，這種蛋白的兩個(gè)主葉之間就會(huì)構(gòu)建出一條作為DNA結(jié)合界面發(fā)揮功能的通道，從而在結(jié)構(gòu)上激活Cas9，使得它能夠與靶DNA結(jié)合，PAM序列則將其核酸酶活性激活[12―14]。
2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
目前，來自于產(chǎn)膿鏈球菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)已被改造為基因組定點(diǎn)編輯的工具。該系統(tǒng)具備兩個(gè)最基本的成分：一個(gè)是起識(shí)別作用的cr-RNA-tracrRNA序列，另一個(gè)是起切割作用的Cas9核酸酶。在對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因編輯時(shí)，需要對(duì)Cas9蛋白編碼基因進(jìn)行優(yōu)化以及添加合適的核定位信號(hào)；此外，還需考慮是分別表達(dá)crRNA和tracrRNA還是嵌合成一條crRNA -tracrRNA，crRNA -tracrRNA又稱向?qū)NA（ gR-NA）c15]。
自2012年首次證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割不同的DNA[10]以來，該系統(tǒng)已經(jīng)成功地應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、番茄、擬南芥、大米、小麥、高粱、鼠、兔子、青蛙、果蠅、蠶、線蟲、斑馬魚及人類細(xì)胞等的基因編輯中[3]。與其他人工核酸酶相比.該RNA介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)一個(gè)顯著的優(yōu)勢就是可以同時(shí)在多個(gè)不同的DNA位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。例如，Cas9和多個(gè)gRNAs的同時(shí)表達(dá)，可在DSBs間造成大片段的刪除和插入[16，17]；可在鼠細(xì)胞中同時(shí)誘導(dǎo)3個(gè)基因的突變[18]；在斑馬魚體細(xì)胞中導(dǎo)致5個(gè)基因的同時(shí)突變等[19]。
Cas9除了可以用于基因的編輯外，還可以對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)Cas9核酸酶的兩個(gè)催化位點(diǎn)全部突變時(shí)，Cas9就變成了沒有核酸酶活性的蛋白質(zhì)（稱為dCas9）；研究表明，dCas9可以結(jié)合在基因的啟動(dòng)子上來抑制基因的表達(dá)[20，21]。當(dāng)gRNA結(jié)合在啟動(dòng)子的上游時(shí)，無論其結(jié)合在DNA的哪條鏈上，dCas9都可以有效地抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；然而，當(dāng)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游時(shí)，只有當(dāng)gRNA結(jié)合在非模板鏈時(shí)，dCas9才能起抑制作用[20]。此外，dCas9還可以作為一個(gè)平臺(tái)招募各種效應(yīng)因子結(jié)合在特異的基因位點(diǎn)上。例如，在人類細(xì)胞[22-25]和小鼠細(xì)胞[2q中，結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子或者轉(zhuǎn)錄抑制子的dCas9可以對(duì)基因的表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用（圖2A）。并且，如果有2―10個(gè)gRNA介導(dǎo)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在同一基因位點(diǎn)，可以進(jìn)一步提高基因調(diào)節(jié)的效率，推測與轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作用相關(guān)[22，23，26，27]。也有研究利用EGFP-dCas9融合物來識(shí)別包含重復(fù)序列的DNA位點(diǎn)，例如端粒[28]（圖2B），若DNA位點(diǎn)包含有重復(fù)序列，則會(huì)結(jié)合有多個(gè)EGFP蛋白，為研究染色體的動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)提供了一種有力的手段，并且使Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用不僅局限于基因的表達(dá)范圍。
這種簡便高效的CRISPR/Cas9技術(shù)填補(bǔ)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基于基因完全敲除而進(jìn)行的大規(guī)?；蚬δ苄院Y選方法的空白，可以針對(duì)細(xì)胞全部基因或某些基因構(gòu)建gRNA文庫，然后經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)行大規(guī)模的篩選。已有研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)人類的部分291個(gè)基因構(gòu)建了包含有869種gRNA的文庫，并且成功地鑒別出了對(duì)于炭疽和白喉毒素毒性事關(guān)重要的宿主基因[29]。也有研究報(bào)道針對(duì)人類或小鼠的全部基因組構(gòu)建了包含有64 000～87 000條gRNA的文庫，通過高通量的敲除技術(shù)對(duì)人類和小鼠細(xì)胞進(jìn)行了基因的功能性篩選鑒定[30-32]。其技術(shù)路線大致相同，都是通過構(gòu)建gRNA慢病毒表達(dá)載體來感染細(xì)胞，然后通過功能性篩選鑒定細(xì)胞，最后經(jīng)過二代基因測序[33] 確定相關(guān)的基因。不同之處在于，有的團(tuán)隊(duì)[31]將gRNA和Cas9串聯(lián)表達(dá)在同一個(gè)慢病毒表達(dá)載體上，通過感染將二者一次性轉(zhuǎn)入細(xì)胞；而有的團(tuán)隊(duì)[30，32] 將二者分別克隆在不同的載體上，先獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞，然后再進(jìn)行g(shù)RNA慢病毒的感染。盡管RNA干擾（RNA interference，RNAi）文庫[34]也曾被廣泛應(yīng)用于功能缺失型基因篩選，但是與gRNA文庫相比，RNA干擾只是下調(diào)某些基因的表達(dá)，常常造成不穩(wěn)定的表型變化，并且文庫構(gòu)建繁瑣，價(jià)格昂貴；而gRNA文庫的構(gòu)建和篩選都非常的簡單，在基因的功能性篩選鑒定方面發(fā)揮了重要作用。
除此之外，CRISPR-Cas系統(tǒng)也可以用來快速地建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動(dòng)物模型。一些人類疾病例如糖尿病、心臟病、精神分裂癥是與多個(gè)基因有關(guān)的，CRISPR多基因同時(shí)編輯的特點(diǎn)為這些疾病模型的建立提供了很好的方法[35，36]。利用傳統(tǒng)方法建立動(dòng)物疾病模型要花費(fèi)1年多的時(shí)間，而使用CRISPR技術(shù)只需幾周即可完成。而且，傳統(tǒng)方法只能用于傳統(tǒng)動(dòng)物的建模，靈長類動(dòng)物體內(nèi)基因精確修飾一直是個(gè)難題，但最近一個(gè)研究小組在猴子體內(nèi)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了精確的基因修飾[37]為我們提供了一種研究人類疾病的新策略。
3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)及提高特異性的策略
【關(guān)鍵詞】胃腫瘤；抑癌基因；Runx3
Runx3（PEBP2αC/CBFA3/AML2）基因是一個(gè)腫瘤抑制基因，其功能缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。自2002年日本學(xué)者Li等［1］首先報(bào)道Runx3有調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的增生與凋亡平衡的作用以來，Runx3與胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究已成為胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)?，F(xiàn)對(duì)Runx3與胃癌的研究現(xiàn)狀做一綜述。
1Runx3基因、蛋白結(jié)構(gòu)及其功能
Runx3來自Runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（Runtdomaintranscriptionfactors），是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員之一，Runt區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子也稱PEBP2/CBF（polyomavirusenhancer-corebindingprotein2/corebindingfactor），是TGF-β超家族信號(hào)重要的靶目標(biāo)，在哺乳動(dòng)物生長過程中扮演重要角色。該基因家族在哺乳動(dòng)物有3個(gè)成員Runx1、Runx2、Runx3，它們的產(chǎn)物都是由α和β亞單位構(gòu)成的異二聚體［2］，具有不同生物學(xué)功能，Runx1與造血功能有關(guān)，Runx2是重要的骨生成調(diào)節(jié)因子，Runx3對(duì)脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)發(fā)育及胃黏膜上皮細(xì)胞的增生調(diào)控和T細(xì)胞的分化起重要作用［1，3］。
Runx3（Runtrelatedtranscriptionfactor3gene）基因位于人染色體的1p36.1，基因全長約67kb，含有P1和P2兩個(gè)啟動(dòng)子，6個(gè)外顯子和1290bp的開放閱讀框，內(nèi)含子1跨越了整條基因全長的一半（35kb）。兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域均含數(shù)個(gè)分離的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，其中Runx3mRNA主要來自于P2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄［3］。兩個(gè)啟動(dòng)子的GC含量不同，P2啟動(dòng)子GC含量高（64％）。在外顯子2相當(dāng)于啟動(dòng)子P2的位置和外顯子6的起始部位有兩個(gè)大CpG島［4］。
人類Runx3蛋白是α、β兩個(gè)亞單位構(gòu)成的異二聚體，包含415個(gè)氨基酸殘基，α亞單位含有一個(gè)RD（Runtdomain）保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128個(gè)氨基酸組成，介導(dǎo)Runx蛋白與DNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)之間的相互作用［5，6］。α亞單位介導(dǎo)RD與靶DNA結(jié)合，β亞單能增強(qiáng)RD與靶DNA的結(jié)合力［7］。
Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和絲氨酸，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用［2，7］。
2Runx3與胃癌的相關(guān)研究及其抑癌機(jī)制
2.1Runx3與胃黏膜的關(guān)系Li等［1］研究發(fā)現(xiàn)敲除Runx3（Runx3-/-）的小鼠胃黏膜明顯增厚，Runx3-/-小鼠培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃組織中半胱天冬酶3（caspase3）無活性［1］。Fukamachi等［8］研究發(fā)現(xiàn)Runx3缺失時(shí)胃黏膜細(xì)胞處于低分化狀態(tài)。這些觀察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生長調(diào)控因子，是胃上皮細(xì)胞中重要的致凋亡因素。
2.2胃癌中Runx3表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中Runx3的表達(dá)明顯下調(diào)或缺失。Li等［1］應(yīng)用RT-PCR、Southernblot和原位雜交方法對(duì)15株胃癌細(xì)胞系和46例胃癌組織標(biāo)本的Runx3mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47%的胃癌細(xì)胞系中Runx3無或低表達(dá);60.9%的胃癌組織中Runx3無表達(dá)或低表達(dá)，Runx3的表達(dá)率與胃癌臨床分期呈負(fù)相關(guān)。所以認(rèn)為Runx3基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的關(guān)系，并且隨著胃癌分期的增高表達(dá)進(jìn)一步降低。Osaki等［9］應(yīng)用Western印跡法分析了6株胃癌細(xì)胞系Runx3蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，結(jié)果50%的細(xì)胞系Runx3表達(dá)陽性，與Li等報(bào)道的結(jié)果基本一致;此外，還通過免疫組化法揭示83例正常胃黏膜組織均有Runx3表達(dá)，而對(duì)應(yīng)的腸上皮化生組織和癌組織中均無Runx3表達(dá)［9］。
2.3Runx3與胃癌的相關(guān)性Li等［1］報(bào)道Runx3-/-、p53-/-小鼠胃黏膜培養(yǎng)細(xì)胞能建立裸鼠種植腫瘤（腺癌），而Runx3+/+、p53-/-小鼠胃黏膜上皮培養(yǎng)細(xì)胞則不能，這表明Runx3功能缺失可能誘導(dǎo)了胃癌的發(fā)生。Guo等［10］以胃癌細(xì)胞系（Runx3-/-）作為感受態(tài)細(xì)胞，將外源性Runx3基因分別轉(zhuǎn)染克隆體，結(jié)果顯示，Runx3高表達(dá)克隆組細(xì)胞生長抑制最明顯，Runx3低表達(dá)組次之，說明Runx3的表達(dá)量與胃癌細(xì)胞的生長曲線成負(fù)相關(guān)。Sakakura等［11］研究發(fā)現(xiàn)胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶Runx3mRNA表達(dá)較正常胃黏膜明顯下調(diào)，尤以腹膜轉(zhuǎn)移灶下降程度最著。將轉(zhuǎn)染外源性Runx3的胃癌細(xì)胞系注入裸鼠腹腔，結(jié)果轉(zhuǎn)染組腹腔內(nèi)極少有種植結(jié)節(jié)，而無轉(zhuǎn)染對(duì)照組動(dòng)物腹腔內(nèi)有大量的、明顯的種植結(jié)節(jié)形成。因此認(rèn)為Runx3基因的失表達(dá)與胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)。Wei等［12］揭示胃癌組織中Runx3表達(dá)水平與患者的生存期密切相關(guān)。Peng等［13］通過對(duì)120例胃癌組織中Runx3表達(dá)與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的相關(guān)分析，揭示Runx3的轉(zhuǎn)錄可能與胃癌組織中VEGF的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。因此Runx3基因沉默可能會(huì)加速胃癌的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
2.4Runx3抑癌機(jī)制Runt區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子與TGF-β超家族成員共同介導(dǎo)一些重要的生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β與其跨膜受體Ⅰ和Ⅱ（TβRⅠ和TβRⅡ）結(jié)合，產(chǎn)生受體異四聚體復(fù)合物（TβRC），從而發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)生物效應(yīng)［14］，此過程中Smad蛋白起重要的作用。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體、受體和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad蛋白共同組成一個(gè)抑制腫瘤信號(hào)的通路。通路異常即可引起信號(hào)紊亂，促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15］。Runx3蛋白是TGF-β信號(hào)通路下游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，Runx蛋白與DNA結(jié)合，在TGF-β/BMP（bonemorphogeneticprotein）信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。只有在Runx蛋白的參與下，Smad復(fù)合物才能從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入核內(nèi)的功能靶點(diǎn)，與Runx蛋白共同轉(zhuǎn)錄激活靶基因，從而對(duì)細(xì)胞的分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用［16］。當(dāng)Runx基因表達(dá)受抑制時(shí)，影響TGF-β信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。
Chi等［17］研究顯示Runx3是p21基因的下游調(diào)控子，p21在細(xì)胞生長周期中有重要作用，其通過抑制周期素依賴性蛋白激酶（cyclin-dependentKinase，CDK）表達(dá)而使細(xì)胞周期停滯于G1期。p21啟動(dòng)子包括5個(gè)Runx結(jié)合位點(diǎn)，即3個(gè)完全匹配的a、b、c位點(diǎn)和2個(gè)部分匹配的d、e位點(diǎn)，當(dāng)Runx結(jié)合域突變時(shí)，p21啟動(dòng)子的活性明顯降低，而Runx3和Smad3協(xié)同表達(dá)時(shí)p21啟動(dòng)子被激活，從而使細(xì)胞對(duì)TGF-β反應(yīng)增強(qiáng)。Runx3的抑癌活性與其誘導(dǎo)p21表達(dá)的能力相關(guān)，p53也是通過調(diào)控p21表達(dá)活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期，故兩者作用機(jī)制類似，但作用的信號(hào)通路不同。最近有研究顯示恢復(fù)Runx3表達(dá)可導(dǎo)致cyclinD表達(dá)下調(diào)，相反p27和caspase3、7和8則表達(dá)上調(diào)。這可能是Runx3誘導(dǎo)凋亡的潛在機(jī)制［14］。
因此，Runx3抑癌機(jī)制主要通過TGF-β信號(hào)通路協(xié)同Smad蛋白激活p21調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期，并通過下調(diào)cyclinD表達(dá)和上調(diào)p27和caspase3、7和8的表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡。
3胃癌中Runx3基因表達(dá)降低或缺失的機(jī)制
3.1Runx3基因突變與表達(dá)基因突變是抑癌基因沉默的主要機(jī)制之一，然而文獻(xiàn)報(bào)道突變不是Runx3表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制［1，12，18］。
3.2Runx3基因雜合性缺失與表達(dá)Li等［1］應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對(duì)15個(gè)胃癌細(xì)胞系和46例胃癌組織Runx3DNA倍體進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%的胃癌細(xì)胞系和30%的胃癌組織中的Runx3為異倍體。并采用RT-PCR方法和原位雜交方法分別對(duì)這些發(fā)生雜合缺失胃癌細(xì)胞系和胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行Runx3mRNA表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)除1例胃癌組織可以檢測到Runx3mRNA表達(dá)外，其余均無Runx3mRNA表達(dá)。22例Ⅰ期胃癌中有3例Runx3存在雜合缺失，2例Ⅱ期胃癌沒有發(fā)現(xiàn)雜合缺失，14例Ⅲ期胃癌中3例Runx3存在雜合缺失，8例Ⅳ期胃癌中Runx3全都發(fā)生雜合缺失變化，說明Runx3的雜合缺失是胃癌中Runx3失活的原因之一，并且Runx3的雜合缺失和胃癌的分期有關(guān)。
3.3Runx3甲基化是胃癌中Runx3表達(dá)下調(diào)的主要原因啟動(dòng)子異常甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、DNA修復(fù)、基因穩(wěn)定及基因抑制方面起重要作用。Runx3啟動(dòng)子P2區(qū)域有一個(gè)典型CpG島，理論上說明DNA甲基化可調(diào)控P2的轉(zhuǎn)錄。
Li等［1］揭示Runx3低表達(dá)或失表達(dá)都與Runx3啟動(dòng)子P2區(qū)域CpG島過甲基化有關(guān)。Guo等［10］用N2甲基2N2亞硝基脲誘導(dǎo)鼠胃癌，從中建立4株胃癌細(xì)胞系，結(jié)果僅一株細(xì)胞系有微量的Runx3mRNA表達(dá)，其他3株細(xì)胞系均無Runx3mRNA表達(dá)，這3株Runx3基因沉默細(xì)胞系在Runx3啟動(dòng)子區(qū)域亦存在明顯甲基化，所有細(xì)胞系經(jīng)過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑52氮唑22脫氧胞苷（deoxycytidine，AZA）、組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素（trichostatin，TSA）共同處理后均恢復(fù)了Runx3表達(dá)。Waki等［19］檢測了10株胃癌細(xì)胞系、93例胃癌組織及相應(yīng)正常胃黏膜組織Runx3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果7株胃癌細(xì)胞系、42例胃癌組織和7例正常胃黏膜組織存在甲基化。此外，對(duì)19例尸檢的正常胃黏膜組織Runx3甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，其中3例存在甲基化，但年齡均≥77歲，提示除高齡患者外Runx3甲基化幾乎是癌特異性的。Kim等［20］對(duì)75例胃癌和各種胃癌前期病變組織（胃腺瘤77例、慢性胃炎伴腸上皮化生32例和慢性胃炎不伴腸上皮化生99例）Runx3甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中Runx3甲基化發(fā)生率為64%，而在各種胃癌前期病變組織中也存在不同程度的Runx3甲基化，其中胃腺瘤27.3%、慢性胃炎伴腸上皮化生28.1%和慢性胃炎不伴腸上皮化生8.1%。而在有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌標(biāo)本100%發(fā)現(xiàn)Runx3甲基化［11］。因此認(rèn)為Runx3甲基化發(fā)生隨癌前期病變向癌的方向發(fā)展而增加，從原位癌到進(jìn)展期胃癌Runx3甲基化率隨之升高，說明Runx3甲基化從胃癌的發(fā)生到胃癌的發(fā)展都有很重要的意義。Homma等［21］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)胃癌細(xì)胞系（90%）、胃癌組織（96%）和配對(duì)的正常胃黏膜組織（96%）均存在Runx3基因5′端CpG島的甲基化，而在被視為導(dǎo)致基因沉默的關(guān)鍵部位——轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近區(qū)域的甲基化發(fā)生率較低，分別為40%、53%和11%。因此認(rèn)為，Runx3基因高甲基化起初發(fā)生在5′端CpG島，進(jìn)而向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)區(qū)域擴(kuò)展，最終導(dǎo)致Runx3mRNA失表達(dá)，Runx3基因CpG島多區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測對(duì)胃癌的診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。
4小結(jié)
Runx3作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡和以細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)及其他生物學(xué)效應(yīng)方面有著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。其啟動(dòng)子P2區(qū)域CpG島的過甲基化和雜合缺失是Runx3基因沉默的主要機(jī)制。Runx3的轉(zhuǎn)錄失活或表達(dá)下調(diào)可致胃黏膜上皮細(xì)胞的過度增生和分化異常，進(jìn)而參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。Runx3有望成為一個(gè)惡性腫瘤，特別是胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)記物和腫瘤基因治療的靶點(diǎn)（如Runx3基因的導(dǎo)入、逆轉(zhuǎn)甲基化治療等），有可能為胃癌等惡性腫瘤的診療提供新的策略和方案。
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【關(guān)鍵詞】高中；生物；生活；方式；學(xué)生
生物課程與現(xiàn)實(shí)生活具有不可分割的關(guān)系，使高中生物課堂回歸現(xiàn)實(shí)生活，為提升課堂教學(xué)有效性開辟全新路徑。當(dāng)前階段高中生物課堂回歸生活的方式已經(jīng)成為現(xiàn)階段教師群體廣泛熱議的話題。
一、知識(shí)導(dǎo)入側(cè)重強(qiáng)調(diào)生活性
新知識(shí)的導(dǎo)入環(huán)節(jié)直接決定著以后的學(xué)習(xí)效果，為了有效構(gòu)建生活化高中生物課堂，教師需要在設(shè)計(jì)導(dǎo)入環(huán)節(jié)時(shí)，緊緊圍繞生活性要求，有意識(shí)的引導(dǎo)學(xué)生分析生物知識(shí)，深化學(xué)生生物知識(shí)源于現(xiàn)實(shí)生活的觀念，生物知識(shí)是無法脫離生活獨(dú)立存在的。在實(shí)際設(shè)計(jì)生活化教學(xué)活動(dòng)時(shí)，需要積極創(chuàng)設(shè)生動(dòng)風(fēng)趣的教學(xué)情景，引導(dǎo)學(xué)生借助實(shí)踐操作由原本的感性認(rèn)知上升至理性層面，這也就需要將生活中較為熟悉的情景或物質(zhì)作為切入點(diǎn)，更容易被學(xué)生所接受理解?，F(xiàn)階段高中生已經(jīng)具備了獨(dú)立的學(xué)習(xí)思維，在設(shè)計(jì)教學(xué)內(nèi)容過程中，教需要充分考慮學(xué)生的學(xué)習(xí)情況，在新課導(dǎo)入環(huán)節(jié)側(cè)重引入生活實(shí)例，積極創(chuàng)設(shè)多元化生活情境，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，進(jìn)而有效加深學(xué)生的學(xué)習(xí)印象[1]。
如：教師在教學(xué)人教版高中生物人教版必修二《人類遺傳病》這一課時(shí)，教師需要在上課時(shí)戴著口罩走到教室，并提出問題：“最近我晚上睡覺有些著涼感冒了，所以我要帶著口罩為你們講課，那么感冒發(fā)熱是不是遺傳??？為什么？”引導(dǎo)學(xué)生翻閱教材尋找問題答案如：遺傳病是由于人的生殖細(xì)胞或受精卵里遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的人類遺傳性疾病，而感冒發(fā)熱是由感冒病原體引起的傳染病，兩者有著根本的區(qū)別。在學(xué)生具備一定基礎(chǔ)上，要求學(xué)生以小組為整體討論“什么是健康的孩子？怎樣才能做到優(yōu)生”的問題，以此來幫助學(xué)生了解人類基因組計(jì)劃的基本內(nèi)容、正負(fù)面影響，知道基因診斷、基因治療的基本知識(shí)。
除此之外，教師也可以創(chuàng)設(shè)形式各異的生活化的情境，以此來不斷刺激學(xué)生的學(xué)習(xí)情緒。在實(shí)際教學(xué)過程中，教師需要側(cè)重引導(dǎo)學(xué)生分析現(xiàn)實(shí)生活中熱點(diǎn)問題，運(yùn)用熱門話題來激發(fā)學(xué)生的求知欲。如：在講到關(guān)于DNA的知識(shí)時(shí)，教師則可以利用近期討論比較激烈的埃博拉病毒為引線，創(chuàng)設(shè)生物知識(shí)學(xué)習(xí)情境，將新聞信息與生物理論基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)合，可以有效樹立學(xué)生關(guān)心國家關(guān)愛社會(huì)的意識(shí)，進(jìn)一步引導(dǎo)學(xué)生自主參與到知識(shí)探究中。
二、不斷密切生物課堂與現(xiàn)實(shí)生活間的關(guān)系
在實(shí)際開展生物課堂教學(xué)活動(dòng)時(shí)，教師可以采取聯(lián)想推理的形式激發(fā)學(xué)生的生活經(jīng)驗(yàn)，引導(dǎo)學(xué)生分析閱讀教材給出的案例，以此來有效調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)思維，加深學(xué)生的情感體驗(yàn)，使學(xué)生自主感受到生物知識(shí)的奧妙，進(jìn)而有效提升學(xué)生的審美能力。同時(shí)，教師在開展教學(xué)活動(dòng)時(shí)，需要盡可能聯(lián)系學(xué)生的現(xiàn)實(shí)生活，采用聯(lián)想法、敘述法、問題法等多種形式來構(gòu)建生活化教學(xué)情景，使學(xué)生可以結(jié)合自己的想法闡述生物知識(shí)[2]。
除此之外，教師還需要深入分析教材內(nèi)容，以教材內(nèi)容為切入點(diǎn)尋找與學(xué)生現(xiàn)實(shí)生活相關(guān)的生物知識(shí)，利用全新信息技術(shù)進(jìn)行教學(xué)，使學(xué)生深刻感受到生物課堂教學(xué)活動(dòng)不再是獨(dú)立存在的個(gè)體，而是與自我現(xiàn)實(shí)生活具有密不可分的關(guān)系，屬于生活中不可缺少的一部分。為了有效開展學(xué)生的學(xué)習(xí)視野，還需要及時(shí)掙脫教育與社會(huì)間的阻礙，將社會(huì)中多元化教學(xué)資源及家庭教育資源進(jìn)行合理引入，以此來滿足學(xué)生不同的學(xué)習(xí)需求。借助此種多管齊下的教育策略可以將生物知識(shí)有效滲透至現(xiàn)實(shí)生活中，此教學(xué)活動(dòng)也更加具備吸引力，進(jìn)而從根本上提升了課堂教學(xué)的質(zhì)量。
三、實(shí)踐操作過程中強(qiáng)調(diào)生活化特性
生物實(shí)驗(yàn)作為課堂教學(xué)活動(dòng)中關(guān)鍵內(nèi)容，教師可以利用實(shí)驗(yàn)操作幫助學(xué)生解析生物知識(shí)的奧秘，為學(xué)生提供操作的機(jī)會(huì)與平臺(tái)，使學(xué)生自主參與知識(shí)探究活動(dòng)中，以此來有效強(qiáng)化學(xué)生的學(xué)習(xí)能力[3]。如：教師在教學(xué)人教版高中生物人教版必修一《能量之源-光與光合作用》這一課時(shí)，教師可以利用班級(jí)內(nèi)中綠植栽種的形式幫助學(xué)生理解生物知識(shí)，并提出如下問題：
（1）根據(jù)所學(xué)的化學(xué)知識(shí)可知，水和二氧化碳反應(yīng)，應(yīng)該生成什么產(chǎn)物？
（2）為什么在植物光合作用的過程中產(chǎn)物不是碳酸而是有機(jī)物？這說明光合作用過程中水和二氧化碳是否直接反應(yīng)？
（3）光合作用的過程究竟是怎樣的？其全過程分為幾個(gè)階段？各階段的變化情況如何？
利用問題使學(xué)生借助實(shí)驗(yàn)操作來求解實(shí)驗(yàn)結(jié)論，不僅可以使學(xué)生對(duì)植物光合作用產(chǎn)生一個(gè)更為深刻的學(xué)習(xí)印象，也可以使學(xué)生理解運(yùn)用自我所學(xué)知識(shí)也是可以解決現(xiàn)實(shí)問題的，有效樹立學(xué)生的學(xué)習(xí)信心，提升學(xué)生學(xué)習(xí)能力的基礎(chǔ)上，提升了課堂教學(xué)質(zhì)量。
結(jié)束語
綜上所述，在學(xué)生現(xiàn)實(shí)生活中可以接觸到許多形式各異的生物現(xiàn)象，若是將高中生物課堂回歸至生活中，不僅可以擴(kuò)寬學(xué)生的學(xué)習(xí)視野，也充分激發(fā)了學(xué)生去探究生物知識(shí)的興趣，解決了傳統(tǒng)課堂教學(xué)活動(dòng)存在的漏洞，從根本上推動(dòng)了高中生物教育工作健康發(fā)展。
作者簡介：張旭陽，男，黑龍江省雞西市人，民族漢，職稱：中學(xué)二級(jí)，學(xué)歷：本科。
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【關(guān)鍵詞】 軟骨組織工程種子細(xì)胞源
多種原因造成的關(guān)節(jié)軟骨病變比較常見，軟骨損傷后缺乏自愈能力，軟骨缺損的修復(fù)一直是臨床的難題。隨著細(xì)胞生物學(xué)和材料科學(xué)的迅速發(fā)展，應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)軟骨病損已成為可能，而優(yōu)化種子細(xì)胞源是應(yīng)用這一技術(shù)的前提和關(guān)鍵［1］。本文就有關(guān)軟骨組織工程種子細(xì)胞源的優(yōu)化獲取、存在的問題及其解決等研究進(jìn)展作一綜述。
1 軟骨組織工程對(duì)種子細(xì)胞源的要求
組織工程軟骨的種子細(xì)胞應(yīng)符合下列要求：來源豐富，取材方便；有較強(qiáng)的增殖傳代能力；與載體材料接種后能保持增殖能力和較高的黏附率，植入受區(qū)后能保持修復(fù)組織的表型；對(duì)機(jī)體或供區(qū)損傷小，臨床應(yīng)用的生物安全性和無明顯的免疫排斥和其他潛在危險(xiǎn)［2］。
2 軟骨組織工程的種子細(xì)胞源
2.1 自體軟骨細(xì)胞
理論上講自體軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程最理想的種子細(xì)胞源，不僅功能相同，不存在免疫排斥反應(yīng)，而且不需要誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。但研究表明種子細(xì)胞濃度為(5～6)×107/ml時(shí)，形成的新生軟骨形態(tài)最佳，但是自體軟骨組織取材受限，軟骨細(xì)胞增殖能力低，難以達(dá)到應(yīng)有的細(xì)胞數(shù)量，體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易發(fā)生去分化而失去原有的表型［3］，因此直接源于自體軟骨組織的種子細(xì)胞，體外單層培養(yǎng)難以獲取大量的細(xì)胞以滿足組織工程對(duì)種子細(xì)胞的需求。
為解決上述難題，使用生物反應(yīng)器三維培養(yǎng)可使軟骨細(xì)胞快速擴(kuò)增，建立能夠長期培養(yǎng)、表型穩(wěn)定的永生化軟骨細(xì)胞。生物反應(yīng)器能控制pH、機(jī)械能力、營養(yǎng)供給條件等，為細(xì)胞的生長、分化提供最適宜的環(huán)境。根據(jù)自體軟骨細(xì)胞培養(yǎng)所需的條件，仿生性地設(shè)計(jì)接近體內(nèi)環(huán)境的軟骨生物反應(yīng)器，模擬了體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境。相同容積的生物反應(yīng)器比普通培養(yǎng)方式，多出數(shù)10倍甚至上100倍的細(xì)胞?？蓽p少細(xì)胞去分化現(xiàn)象，有利于細(xì)胞表型的維持，提高種子細(xì)胞的質(zhì)量。有利于軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增及表型維持。
2.2 同種異體軟骨細(xì)胞
與體內(nèi)其他組織相比，軟骨有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特點(diǎn)。軟骨無血管、淋巴管和神經(jīng)，細(xì)胞包埋在由軟骨基質(zhì)形成的軟骨囊內(nèi)，可阻擋免疫細(xì)胞直接與其接觸，不易被機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊，軟骨基質(zhì)抗原性低，一般不引起或僅有輕微的免疫反應(yīng)，獲取種子細(xì)胞時(shí)要經(jīng)過消化分離和體外培養(yǎng)等一系列處理，軟骨細(xì)胞表面抗原可被進(jìn)一步消弱。同種異體軟骨來源廣，易獲取，一次可獲取大量軟骨細(xì)胞，所以同種異體軟骨是值得研究的種子細(xì)胞來源［5］。應(yīng)用同種異體軟骨細(xì)胞作種子細(xì)胞，在具有免疫力動(dòng)物體內(nèi)形成同種異體工程化軟骨，并用于軟骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)［6］。研究表明胚胎來源的軟骨細(xì)胞較成體軟骨細(xì)胞引起的異體排斥反應(yīng)微弱，提示在同種異體軟骨組織工程中，胚胎來源的軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞是最佳選擇［7］。對(duì)同種異體軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性和相關(guān)免疫反應(yīng)問題的進(jìn)一步研究，將為建立軟骨組織工程種子細(xì)胞庫奠定基礎(chǔ)。
2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)
骨髓中存在具有向多種細(xì)胞系分化潛能的BMSCs。Friedenstein發(fā)現(xiàn)骨髓中存在少量可以貼壁繁殖的BMSCs，條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)可分化成為軟骨細(xì)胞。Cancedda等［8］對(duì)BMSCs和骨膜細(xì)胞修復(fù)兔股骨髁軟骨全層缺損進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者均能形成軟骨和軟骨下骨。
ButnariuEphrat等［9］用BMSCs復(fù)合聚合物支架，自體和異體移植修復(fù)股骨負(fù)重區(qū)軟骨缺損，結(jié)果自體BMSCs早期形成類透明軟骨，異體BMSCs的免疫反應(yīng)導(dǎo)致后期纖維化和骨關(guān)節(jié)炎改變。Gao等［10］分別用成骨和成軟骨條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠BMSCs，復(fù)合不同材料的雙層支架植入裸鼠背部皮下，術(shù)后1周檢測新生組織中含有Ⅰ、Ⅱ型膠原，認(rèn)為BMSCs在不同生物活性因子的作用下，結(jié)合相應(yīng)的生物材料可以構(gòu)建出工程化的骨軟骨復(fù)合體，因此，目前認(rèn)為BMSCs是一種比較理想的種子細(xì)胞源。盡管BMSCs只有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能性，但其數(shù)量在全骨髓中僅占1／105～1/104，并且隨傳代次數(shù)的增加，其軟骨分化潛能逐漸降低，必須通過適當(dāng)?shù)目刂茥l件和誘導(dǎo)因素，使BMSCs保持增殖并分化為軟骨細(xì)胞，也有研究表明重癥骨關(guān)節(jié)炎病人BMSCs的成軟骨能力明顯降低［11］，并且最近研究證實(shí)當(dāng)BMSCs培養(yǎng)傳代90次后細(xì)胞發(fā)生癌變，聲稱這符合腫瘤細(xì)胞源于干細(xì)胞的假說，因此對(duì)BMSCs應(yīng)用的生物安全性必須引起高度重視和深入研究［12］。
2.4 BMSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)
基于BMSCs和軟骨細(xì)胞均不能完全滿足組織工程對(duì)種子細(xì)胞的要求，那么將2種細(xì)胞優(yōu)勢互補(bǔ)，進(jìn)行共培養(yǎng)來優(yōu)化和擴(kuò)大軟骨組織工程的種子細(xì)胞源就成為可供選擇的方式。Tsuchiya等［13］用不同比例的人BMSCs和牛軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BMSCs數(shù)量比例愈高軟骨細(xì)胞表達(dá)的Ⅱ型膠原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培養(yǎng)前的細(xì)胞比例，因此BMSCs能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和基質(zhì)形成，其原因是共培養(yǎng)系統(tǒng)中BMSCs分泌的活性生長因子(TGF)，通過軟骨細(xì)胞介導(dǎo)自分泌或旁分泌上調(diào)了軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成。Goldberg等［14］用添加TGF β的培養(yǎng)基培養(yǎng)去分化的軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明添加TGFβ能使去分化的軟骨細(xì)胞重新分化，從而維持了軟骨細(xì)胞的表型。在構(gòu)建工程化軟骨組織中，利用BMSCs增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，少量軟骨細(xì)胞的微環(huán)境能誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞，比單純軟骨細(xì)胞構(gòu)建的軟骨組織更為成熟，也避免了軟骨細(xì)胞長期培養(yǎng)傳代而導(dǎo)致的老化和去分化，并且節(jié)省了軟骨細(xì)胞的用量。因此BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)優(yōu)化和擴(kuò)大種子細(xì)胞源可能是一種實(shí)用的策略。
2.5 軟骨膜細(xì)胞或骨膜細(xì)胞
骨膜和軟骨膜生發(fā)層含未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，在低氧張力、無血供的關(guān)節(jié)腔內(nèi)分化為軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑液和使用CPM是促使間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的有利因素。Wakitani等［15］培養(yǎng)兔脛骨膜細(xì)胞，修復(fù)兔股骨髁全層軟骨缺損，24周時(shí)軟骨下骨完全形成，新生軟骨組織無骨化現(xiàn)象。Chu等［16］用異體肋軟骨膜細(xì)胞和PLA支架修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損，96％的缺損6周時(shí)為軟骨填充，Ⅱ型膠原比例隨時(shí)間延長而升高，說明關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境刺激新生組織向透明軟骨方向發(fā)展，黏多糖含量12個(gè)月時(shí)降低，軟骨下骨厚度為正常的50％，認(rèn)為異體移植的免疫反應(yīng)和PLA降解產(chǎn)物的酸性環(huán)境影響了軟骨下骨結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致新生軟骨生物力學(xué)性能下降和纖維化。
2.6 肌肉源性基質(zhì)干細(xì)胞(musclederived stromal cells)
Pate等［17］使用凍融方法和地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)兔肌源性基質(zhì)干細(xì)胞，形成了軟骨結(jié)節(jié)和含有硫酸黏多糖的細(xì)胞外基質(zhì)。青年和老年人的肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)出現(xiàn)同樣的結(jié)果［18］。Adachi等［19］用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或肌源性干細(xì)胞復(fù)合II型膠原凝膠修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損區(qū)，24周后可見缺損區(qū)呈軟骨樣修復(fù)，優(yōu)于不含細(xì)胞的I型膠原凝膠對(duì)照組，認(rèn)為肌源性干細(xì)胞取材方便，細(xì)胞倍增時(shí)間短，可以作為修復(fù)軟骨損傷的種子細(xì)胞源和基因治療的靶細(xì)胞。
2.7 脂肪源性基質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissuederived stromal cells，ADSC)
為提供更多間充質(zhì)細(xì)胞的自體組織，Erickson等［20］用Ⅰ型膠原酶消化人吸脂術(shù)中的皮下脂肪，經(jīng)梯度密度離心獲取基質(zhì)干細(xì)胞，使用普通和軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含TGFβ1和地塞米松)三維培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下4～12周取材，免疫組織化學(xué)和RTPCR檢測表明：軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液體外培養(yǎng)1周和植入裸鼠體內(nèi)的標(biāo)本均有明確的成軟骨特征，而使用普通培養(yǎng)液的對(duì)照組則陰性，類似結(jié)果亦見于大鼠脂肪來源的干細(xì)胞［21］。源于脂肪組織的基質(zhì)干細(xì)胞，因脂肪組織在體內(nèi)廣泛存在，取材方便，對(duì)人體造成的創(chuàng)傷相對(duì)較小，是目前獲取種子細(xì)胞的新途徑，也是研究的熱點(diǎn)，其細(xì)胞表型與BMSCs非常相似，均表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLADR及Ckit表型，同時(shí)其增殖能力優(yōu)于BMSCs［22］。然而Hui等［23］在修復(fù)軟骨缺損的研究發(fā)現(xiàn)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下其修復(fù)效果不如BMSCs。由于該細(xì)胞為誘導(dǎo)性干細(xì)胞，體外培養(yǎng)時(shí)必須在持續(xù)誘導(dǎo)條件下才能分化為軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)難度相對(duì)較大并且其成軟骨機(jī)制尚不完全清楚。如能掌握脂肪組織基質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨機(jī)制和性能，在體外培養(yǎng)持續(xù)向軟骨細(xì)胞分化，則不失為一種優(yōu)秀的種子細(xì)胞源［24］。
2.8 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)
胚胎干細(xì)胞來自早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或尿生殖嵴，胚胎干細(xì)胞是全能干細(xì)胞，可分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞，種植于體內(nèi)可形成包含三胚層細(xì)胞的畸胎瘤。改變體外培養(yǎng)條件，可使胚胎干細(xì)胞向不同的細(xì)胞系分化，文獻(xiàn)報(bào)道胚胎干細(xì)胞在BMP2和BMP4的作用下可分化為軟骨細(xì)胞［25］，胚胎干細(xì)胞與已分化的成熟軟骨細(xì)胞相比，除具有更強(qiáng)的增殖能力外，還具有再生潛能，可維持整個(gè)生命過程中細(xì)胞的更新和正常的功能，因而胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞可能更為優(yōu)勢。但使用胚胎干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞，體外培養(yǎng)要求嚴(yán)格，自發(fā)分化難以控制，分化多具致瘤性，安全性難于把握，臨床使用尚存在倫理學(xué)問題。
3 基因修飾的種子細(xì)胞
多種細(xì)胞因子有促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用。通過基因重組技術(shù)，將細(xì)胞因子基因?qū)胲浌羌?xì)胞或相關(guān)細(xì)胞，使之在病損部位分泌生長因子并維持所需的濃度和時(shí)間，有效促進(jìn)軟骨的修復(fù)，這就是基因修飾的組織工程技術(shù)(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激軟骨細(xì)胞增殖和Ⅱ型膠原與蛋白多糖的合成。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞可標(biāo)記軟骨細(xì)胞的示蹤。研究表明，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和BMP-4的調(diào)控下，可在體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)保留其分泌Ⅱ型膠原等的特性。Sellers等［26］用含rhBMP2的I型膠原海綿修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，24周時(shí)新生軟骨厚度達(dá)到正常軟骨的70％和潮線形成，rhBMP2組與單純膠原海綿和曠置組間的差異只有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是外源性生長因子半衰期短，需較大劑量或連續(xù)給藥才能發(fā)揮作用，增加了治療成本。Baragi等［27］以腺病毒攜帶lacZ作為報(bào)告基因，人白介素-1受體拮抗物(hIL-1ra)cDNA作為治療基因，用骨關(guān)節(jié)炎軟骨標(biāo)本體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞和小軟骨薄片，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的軟骨基質(zhì)變性，認(rèn)為基因修飾后的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物學(xué)功能，在一定程度上彌補(bǔ)了自體軟骨細(xì)胞供量不足的缺陷，縮短體外培養(yǎng)時(shí)間，更好地維持其表型。
多項(xiàng)研究表明以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或脂質(zhì)體等作為載體，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞或直接注入病變部位是可行的，基因工程技術(shù)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域可以使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)軟骨修復(fù)的生長因子，但病毒類載體潛在的致畸性、免疫源性以及脂質(zhì)體對(duì)種子細(xì)胞的毒性和轉(zhuǎn)染率低等尚需進(jìn)一步改進(jìn)。
4 展望
種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程化軟骨和應(yīng)用研究中的首要環(huán)節(jié)和基本要求，也是保證軟骨組織工程學(xué)持續(xù)性深入研究的前提。影響優(yōu)化軟骨種子細(xì)胞源的因素眾多，目前研究的種子細(xì)胞各具優(yōu)缺點(diǎn)，尚沒有一種細(xì)胞能夠完全滿足軟骨組織工程對(duì)種子細(xì)胞的要求，今后需要開發(fā)和挖掘更多的種子細(xì)胞源，并在模擬體內(nèi)的微環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，建立種子細(xì)胞的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，優(yōu)化出理想的種子細(xì)胞，為軟骨組織工程的研究和臨床應(yīng)用提供可靠保證。BMSCs相關(guān)研究和技術(shù)比較成熟，今后的研究重點(diǎn)是如何保證細(xì)胞能在特定的時(shí)間內(nèi)定向擴(kuò)增到臨床治療所需的數(shù)量，并避免致瘤性的產(chǎn)生。BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)可能為解決上述問題提供了一種實(shí)用的策略，但兩種細(xì)胞間的相互作用機(jī)制尚需進(jìn)行深入研究。目前脂肪基質(zhì)細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究相對(duì)滯后，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)其成軟骨機(jī)制和性能也會(huì)不斷了解，優(yōu)勢會(huì)逐漸顯現(xiàn)。當(dāng)然，種子細(xì)胞的優(yōu)化只是軟骨組織工程學(xué)研究的第一步，今后還要解決細(xì)胞所需載體及細(xì)胞與載體相容性及相互作用等問題，當(dāng)最終運(yùn)用到臨床尚需考慮免疫排斥性問題。 參考文獻(xiàn)
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