發(fā)布時間：2023-08-01 17:07:21
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因治療的策略樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
【關(guān)鍵詞】 拇外翻；術(shù)后骨不連；原因；治療
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.25.015
【Abstract】 Objective To summarize causes and treatment measures for postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics. Methods There were 6 patients with postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics， 1 case among them had postoperative nonunion after first metatarsal distal osteotomy， and the other 5 cases had postoperative nonunion after first metatarsal backbone and base osteotomy. All the 6 cases received revision surgery （debridement + bone grafting internal fixation）. Results After surgery， all wound had first stage healing. Follow-up for the patients lasted for 12～18 months， with the average time as 15 months. X-ray examination in the last follow-up showed complete heal in osteotomy end， without malformation or abnormal movement. Conclusion Main cause of postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics is poor local bone quality， such as osteoporosis， in fection-induced failed internal fixation， and wide range of soft tissue dissection in surgery， which will influence blood flow for supplying metatarsal bones. Treatment measures are mainly based on first metatarsal shortening degree and complicated lesion in soft tissue.
【Key words】 Hallux valgus； Postoperative nonunion； Causes； Treatment
拇外翻矯形術(shù)后骨不連的發(fā)生率為1.6%～3.0%[1， 2]。由于拇外翻患者個性之間病理的差異性和手術(shù)方式的多樣性， 即使對于有經(jīng)驗的足踝外科醫(yī)生， 手術(shù)并發(fā)癥也不可避免?，F(xiàn)回顧2010年1月～2011年6月收治的6例拇外翻矯形術(shù)后骨不連患者的臨床資料， 總結(jié)骨不連發(fā)生原因及治療策略?，F(xiàn)報告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 本組6例患者中男1例， 女5例；年齡21～68歲， 平均年齡44.5歲；其中1例是第一跖骨遠端截骨術(shù)（Mitchell）后骨不連， 因骨質(zhì)疏松導致內(nèi)固定失效所致， 病程6個月。2例原術(shù)式為Ludloff截骨， 因患者較早負重造成截骨面不穩(wěn)定導致骨不連， 病程9個月。1例原術(shù)式為Scarf截骨， 病程11個月?；颊哂?型糖尿病史20年。1例原術(shù)式為Juvara截骨， 病程9個月， 因嚴重骨質(zhì)疏松導致內(nèi)固定失效所致。1例原術(shù)式為第一跖骨基底弧形截骨， 病程10個月， 因內(nèi)固定不牢靠， 截骨端分離導致骨不連。
1. 2 方法 連硬麻醉下， 患者取仰臥位， 上止血帶后手術(shù)。取第一跖骨內(nèi)側(cè)做一縱行切口， 切開皮膚全層， 分辨關(guān)節(jié)囊表面內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)， 將神經(jīng)拉向背側(cè)， 術(shù)中顯露并松解骨不連部位后， 徹底清創(chuàng)， 清除瘢痕組織， 所有硬化和壞死組織， 通過錐板撐開器恢復跖骨長度， 恢復跖骨長度后， 立即用多根克氏針橫穿第一、二和三跖骨， 臨時固定第一跖骨， 再考慮如何最終固定， 根據(jù)骨不連的部位及跖骨缺損程度再行決定行結(jié)構(gòu)性植骨或植入同種異體松質(zhì)骨顆粒， 再聯(lián)合應(yīng)用空心釘和鋼板進行固定。
1. 3 術(shù)后處理 術(shù)后1 d， 傷口更換輔料， 術(shù)后2～3 d患足拍X線片， 術(shù)后2周拆線， 穿前足減壓勉負重鞋6周， 因為血管長入植骨塊的速度較慢， 直到新生骨小梁通過時才允許負重（通常需6～8周）， 8周后再拍X線片， X線證實骨愈合后， 開始完全負重。
2 結(jié)果
術(shù)后切口均一期愈合， 患者均獲隨訪， 隨訪時間12～18個月， 平均隨訪15個月， 末次隨訪時， X線片顯示6例骨不連完全愈合。未出現(xiàn)畸形愈合及轉(zhuǎn)移性跖骨痛， 鋼板取出后跖趾關(guān)節(jié)有40～45°活動度。
3 討論
臨床認為跖骨截骨后6～8個月沒有發(fā)生愈合為骨不連， 引起骨不連的確切原因尚不清楚， 但全身因素和局部因素均發(fā)揮作用， 全身性因素包括患者的代謝和營養(yǎng)狀況， 一般健康狀況和活動情況。最近有報道吸煙與骨不連有關(guān)[3]， 據(jù)報道：吸煙患者皮膚和皮下組織的血氧水平較低， 從而導致傷口愈合不良。另外， 大量的動物實驗證明非甾體抗炎藥降低了截骨端愈合率。Vora [4]分析了26例拇外翻矯形術(shù)后骨不連患者， 發(fā)現(xiàn)與以下幾種局部因素有關(guān)：①截骨后內(nèi)固定不牢靠， 固定時間不足；②術(shù)中軟組織剝離范圍大， 影響了供應(yīng)跖骨的血運；③局部骨質(zhì)量差， 如骨質(zhì)疏松；④跖骨遠端截骨后外移過多， 一般大于跖骨頸的1/2；⑤感染致內(nèi)固定失效；⑥術(shù)后過早負重或粗暴的功能鍛煉。
第一跖骨不論何種類型截骨引起的骨不連， 在骨不連的界面可能存在缺血的骨塊， 清創(chuàng)后， 不愈合伴隨跖骨短縮會更明顯。清創(chuàng)能使骨端出血， 促進愈合， 但清創(chuàng)也能導致第一跖骨進一步短縮， 增加足外側(cè)跖骨痛的發(fā)生率。治療策略取決于是否合并跖骨痛， 第一跖骨現(xiàn)有的短縮程度， 是否存在跖趾關(guān)節(jié)的骨性關(guān)節(jié)炎以及合并的軟組織病變（包括瘢痕、攣縮及神經(jīng)炎）。在治療骨不連時， 要確定是否需要恢復跖骨長度進行結(jié)構(gòu)性植骨， 還是單純進行松質(zhì)骨顆粒植骨以促進愈合。骨干利于固定， 而干骺端利于愈合。術(shù)中在截骨不愈合端清創(chuàng)后， 用錐板撐開器恢復第一跖骨長度， 但同時要確保第一跖趾關(guān)節(jié)界面不要有太大壓力， 因為這樣會降低拇指的活動度。注意事項：①治療骨不連時必須考慮患者的全身和局部因素處理， 治療骨不連前患者應(yīng)有良好的代謝和營養(yǎng)狀況， 鼓勵患者戒煙， 活動水平可根據(jù)不同需要而改變；②在制定治療計劃時必須考慮骨不連周圍軟組織的狀況， 不能伸展的瘢痕組織， ?？蓪е缕つw壞死；③骨不連的治療要求在恢復第一跖骨長度的前提下， 充分植骨和堅強固定；④植骨時骨的來源很多， 有自體骨、異體骨、人工合成骨替代物等。由于自體骨具有骨傳導（基質(zhì)）和骨誘導（蛋白質(zhì)）的特性， 同時又含有骨原細胞， 是一種理想的植骨材料[5]， 自體骨松質(zhì)通常取自髂骨；⑤治療骨不連的內(nèi)固定應(yīng)提供足夠穩(wěn)定的固定， 但不要過于堅強；⑥建議骨不連患者在治療過程中盡可能避免應(yīng)用非甾體類抗炎藥和激素；⑥值得注意的是骨不愈合的治療目的不僅僅是促進愈合， 還要注意糾正跖骨的非正常位置避免畸形愈合。
參考文獻
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關(guān)鍵詞： 顱內(nèi)腫瘤；膠質(zhì)瘤；基因治療；靶向治療；綜述文獻
1 膠質(zhì)瘤基因治療的分子策略
當前膠質(zhì)瘤基因治療的分子策略包括以下幾點：細胞周期調(diào)節(jié)基因及凋亡基因；自殺基因；免疫調(diào)節(jié)基因；抑癌基因；血管生成抑制基因；PKR途徑。以上各策略可相互聯(lián)系,并相互聯(lián)合。
1.1 細胞周期調(diào)節(jié)基因及凋亡基因
P53與E2F1作為2種非常重要的抑癌基因, 維持基因組的穩(wěn)定, 激活細胞凋亡。兩者所不同的是P53基因可調(diào)節(jié)細胞周期，其變異能明顯降低惡性腦膠質(zhì)瘤對化療的敏感性, P53基因在腦膠質(zhì)瘤的高突變率為腦膠質(zhì)瘤的靶向性基因治療提供了重要的基礎(chǔ)［2］。與P53基因不同的是，E2F1是直接調(diào)控細胞周期［3］，其不良反應(yīng)是它對正常細胞的毒性和潛在的致瘤性。
1.2 自殺基因
自殺基因治療在膠質(zhì)瘤的基因治療中占有極為重要的地位。自殺基因(suicide gene)療法是指將某些病毒的基因轉(zhuǎn)導入腫瘤細胞，此基因編碼的特異性酶類能將細胞無毒或毒性極低的藥物前體在腫瘤細胞內(nèi)代謝成細胞毒性產(chǎn)物，以達到殺死腫瘤細胞為目的。不少學者［4］通過研究發(fā)現(xiàn)， 只要少量的自殺基因轉(zhuǎn)染的癌細胞與未轉(zhuǎn)染的癌細胞按一定比例混合后共同培養(yǎng)，不僅轉(zhuǎn)染的癌細胞被殺滅，二者相互接觸后相鄰的未轉(zhuǎn)染的癌細胞也大量死亡，即“旁觀者效應(yīng)”。該效應(yīng)可使僅部分腫瘤細胞轉(zhuǎn)染了自殺基因的整個腫瘤均受到經(jīng)自殺基因轉(zhuǎn)化了的抗癌“藥”的攻擊而全部消退。至于旁觀者效應(yīng)發(fā)生的機理, 多數(shù)研究表明它與細胞間的縫隙連接和免疫效應(yīng)細胞在腫瘤病灶中的浸潤有關(guān)。（1）細胞毒性產(chǎn)物通過細胞間的縫隙連接進入鄰近細胞。（2）被破壞的細胞釋放毒性物質(zhì)和凋亡小體進入周圍微環(huán)境, 并被鄰近細胞攝取。（3）自殺基因殺死的細胞釋放細胞因子, 進一步吸引免疫細胞進入腫瘤, 介導抗腫瘤免疫反應(yīng)。（4）導致血管內(nèi)皮細胞死亡, 引起腫瘤細胞缺血壞死。在腫瘤細胞中旁觀者效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)一縫隙連接數(shù)量較正常細胞缺乏, 利用環(huán)腺昔酸（cAMP）可以誘導縫隙連接形成或?qū)肟p隙連接的亞單位連接素43（connexin 43）的cDNA, 從而大大加強旁觀者效應(yīng)［5］。臨床上，意大利的Colombo等［5］用結(jié)合的IL2／HSV．tk基因療法治療再生的多形惡性膠質(zhì)細胞瘤，他們向瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)錄病毒載體引導細胞(PVPC)，然后靜脈注射GCV，結(jié)果顯示，實驗組的患者的存活率提高。
1.3 免疫調(diào)節(jié)基因
免疫調(diào)節(jié)基因主要是通過基因重組技術(shù)來增強機體的抗腫瘤免疫功能達到治療腫瘤的目的，這主要包括3個方面：（1）腫瘤抗原提呈功能的加強，如從臨床患者的血液和手術(shù)切除標本中獲取自身抗原提呈細胞，在體外經(jīng)GMCSF等細胞因子作用下擴增，體外表達腫瘤抗原的DNA或mRNA，然后回輸入患者體內(nèi)；（2）細胞因子基因轉(zhuǎn)導腫瘤細胞；如將一基因體外轉(zhuǎn)導腦膠質(zhì)瘤細胞, 體外培養(yǎng)擴增后接種于病人自身皮下, 可發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶明顯縮小, 顱內(nèi)膠質(zhì)瘤明顯壞死。（3）B7共刺激分子基因?qū)肽[瘤細胞［7］。Mukhecjee等［8］在靶向T11結(jié)構(gòu)的一種蛋白質(zhì)(aprotein known as T11 target structure，T11 )注射N乙基·N·亞硝基脲（ ENU)誘導的免疫抑制大鼠后，觀察外周和神經(jīng)系統(tǒng)的改變以及脾，腦浸潤淋巴細胞的細胞毒性活性變化，用流式細胞儀測定腫瘤細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞含量，發(fā)現(xiàn)T11TS不僅增加了凋亡細胞的數(shù)目，同時降低了分裂細胞數(shù)目，而脾和腦浸潤細胞的細胞毒性也有顯著增加。數(shù)據(jù)證實了TILTS對實驗?zāi)X腫瘤的特殊細胞凋亡作用。
1.4 抑癌基因治療
抑癌基因亦稱為抗癌基因，是指正常細胞內(nèi)存在的能抑制細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群。目前已分離克隆出20余種抑癌基因，而D53基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，不少研究也證明腫瘤的生成會伴隨p53的缺失。Michiue等［8］使用了基因突變的p53蛋白，將羧基末端的多賴氨酸殘基用精氨酸取代的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)導人膠質(zhì)瘤細胞，由于存在對Mdm2(鼠雙微基因)介導的遍蛋白化耐受性，這種蛋白具有較強的轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)活性，同時抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，表現(xiàn)了其在P53基因治療方面的應(yīng)用潛力。
1.5 血管生成抑制基因
固體腫瘤的生長及增殖，需要新生血管提供足夠的血運。而膠質(zhì)瘤自身能產(chǎn)生一些血管生長因子，促進血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖。因此抑制腫瘤血管形成成為冶療腫瘤的另一策略。早在1971年Fdkamn首先發(fā)現(xiàn)腫瘤血管生成因子，并由此提出了對腫瘤血管調(diào)控因子及其作用環(huán)節(jié)進行干預，經(jīng)抗血管生成途徑治療腫瘤的新方法。它的優(yōu)勢是：（1）抗腫瘤血管生成治療不是直接攻擊腫瘤細胞, 不會產(chǎn)生放療和化療所造成的腫瘤細胞遺傳性狀的不穩(wěn)定和治療后耐藥性。（2）由于腫瘤部位的血管內(nèi)皮細胞比腫瘤細胞遺傳性狀穩(wěn)定, 而正常血管內(nèi)皮細胞處于不分裂的狀態(tài), 故抗腫瘤血管生成治療對其影響不大。（3）另外由于內(nèi)皮細胞本身就浸泡在血液中, 藥物到達血管比到達腫瘤要容易得多。這說明抗腫瘤血管生成治療與傳統(tǒng)治療相比有內(nèi)在的優(yōu)勢, 已成為一種重要輔助治療方式。膠質(zhì)瘤作為一種實體瘤, 抗腫瘤血管生成治療也具有重要價值。
1.6 PKR途徑
活化性雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)是一種生長抑制性蛋白, 通常它能使病毒感染的細胞活化, 并誘導其死亡［10］。
2 靶向性基因治療研究
【關(guān)鍵詞】 癌癥；基因治療；優(yōu)勢
癌癥是危害人類健康的第一大殺手。雖然目前醫(yī)療技術(shù)不斷進步，科技含量的比重越來越大，抗癌的手段越來越多，但還是不能完全消除癌癥的威脅，很多癌癥患者因保守癌癥的摧殘和折磨而痛不欲生。隨著基因工程的不斷崛起，用以病毒為載體的基因治療方法來對付癌癥，已成為國內(nèi)外醫(yī)學癌癥專家的研究方向。
1 癌瘤的形成機理
癌細胞繁殖多了，便會結(jié)成癌瘤。癌細胞海輝擴散開來，在身體的各處生產(chǎn)癌瘤。它們行為放肆，無時無刻不在消耗身體的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，毫無忌憚地浪費身體的資源。打個比方來講，一個葡萄糖分子，有正常細胞來利用，可以產(chǎn)生38個ATP，而如果由癌細胞來用，只產(chǎn)生2個ATP，然后便將其余的能量分子全部當做垃圾丟掉了。大部分的癌癥病人，到了晚期，身體的營養(yǎng)都被癌細胞消耗掉了，因此看起來骨瘦如柴，毫無生氣。
2 病毒殺掉癌細胞的原理
所謂以病毒為載體的基因治療，也就是我們來合成病毒，讓其鉆進癌細胞，并在癌細胞內(nèi)部生活和繁殖，毫不留情地消耗掉癌細胞的生存資源，使得癌細胞“死掉”，從而起到治療癌癥的作用。簡單來說，就是“以其癌之道反之其癌之身”。
3 癌癥基因治療中常用的病毒載體
癌癥的基因治療是根據(jù)不同癌癥的發(fā)病機制，通過合適的載體將腫瘤抑制 基因、炎癥因子基因或小RNA等治療基因?qū)氲侥[瘤細胞中。理想的載體是安全性高、能有效將足量治療基因針對性地導入靶細胞中(包括目標組織內(nèi)的靶細 胞)，并能在其中持續(xù)特定時間表達治療劑量的分子。
目前，癌癥基因治療相關(guān)的載體系統(tǒng)仍處于研發(fā)階段，常用載體主要有兩類：病毒載體和非病毒載體。非病毒載體主要包括直接注射或借助物理化學手段，如電轉(zhuǎn)化、超聲波、脂質(zhì)體等，將的DNA或RNA直接導入病灶細胞中，缺點是轉(zhuǎn)入效率低，且在體內(nèi)不能長久表達。病毒是一類由核酸(DNA或RNA)和蛋白質(zhì)組成的寄生于活細胞中的微生物，由于其高感染性，經(jīng)改裝后病毒載體可將外 源基因高效轉(zhuǎn)入宿主細胞。病毒載體依據(jù)其在宿主細胞中增殖與否，分為復制型與非復制型病毒載體。出于安全考慮，非復制型病毒載體在近20年一直廣泛應(yīng) 用于疫苗及基因治療研究，腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒。是目前 最常用于基因治療的病毒載體.
近幾年，癌癥基因治療載體已開始逐漸由非復制型病毒載體向復制型載體 過渡。復制型載體的特點是病毒能夠選擇性地在目標癌細胞中復制增殖，介導細胞裂解，釋放出的病毒繼而感染腫瘤實體中的鄰近細胞，從而形成一個在瘤體組織中不斷感染—增殖—裂解癌細胞的循環(huán)。非復制型病毒載體的一個明顯缺陷是無法感染腫瘤實體內(nèi)部大部分細胞，因此不能最大限度地控制癌細胞的增殖及 轉(zhuǎn)移，而復制型病毒載體則可克服這種缺陷。復制型腫瘤裂解載體的效果目前已在臨床前試驗中得到廣泛驗證，且已進入臨床試驗階段。
4 結(jié)論與展望
癌癥是由多種因素導致的疾病，發(fā)病機制復雜，單一療法很難治愈，未來的 腫瘤治療必定是多種策略聯(lián)合使用，包括更靈敏的診斷試劑、癌癥疫苗，以及繼 傳統(tǒng)療法之后新興的基因療法、免疫療法等多種生物療法。作為治療癌癥非常有潛力的一種策 略，基因治療通過最大限度地加強病毒載體對腫瘤細胞的特異性，以及盡可能地減少對正常細胞的副作用。而將為癌癥患者提供比傳統(tǒng)療法更有效 的治療效果和安全性。
小分子和蛋白類藥物的諸多缺點，限制了其在實際治療中的應(yīng)用。而將溶瘤腺病毒應(yīng)用于靶向腫瘤干細胞的癌癥治療非常適合。但在實際應(yīng)用中，仍有一些需要解決的問題。首先是如何進一步提高腺病毒對腫瘤干細胞的靶向性。我們可以通過改造病毒外殼蛋白來達到此目的。外殼纖維蛋白(fiber)頭部的HI環(huán)決定腺病毒靶向細胞的類別，其內(nèi)部序列的變化會影響fiber與靶細胞表面受體的相互識別，從而改變病毒的靶向性。Reynolds等[1]將RGD三肽插入HI環(huán)區(qū)內(nèi)，改造后5的型腺病毒可以轉(zhuǎn)染不表達柯薩奇—腺病毒受體(coxsackie—adenovirusreceptor,CAR)的細胞，改變了其原先的靶向性。若對fiber的HI環(huán)的氨基酸殘基序列進行改造，使之擁有與腫瘤干細胞表面特異受體的強結(jié)合力，可以使腺病毒獲得對腫瘤干細胞的靶向性，提高感染率。
參考文獻
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關(guān)鍵詞：肺癌；自殺基因；端粒酶催化亞單位；靶向性表達
中圖分類號：R734.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0273－06
人端粒酶催化亞單位(human telomerasecatalytic subunit，hTERT)是端粒酶的重要組成部分，其活性是端粒酶活性的決定性因素，幾乎所有分化成熟的正常體細胞均無端粒酶表達，而85％以上的腫瘤細胞中有高水平的端粒酶活性，因此，hTERT基因的表達也具有高度的腫瘤特異性，對端粒酶的深入研究結(jié)果顯示，hTERT基因表達的調(diào)節(jié)是多水平的，其中hTERT啟動子在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最主要的調(diào)節(jié)機制，因此，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的hTERT基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性也應(yīng)該具有高度腫瘤特異性，基于此，如果用hTERT啟動子作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，來調(diào)控治療基因在腫瘤細胞異性表達，有可能實現(xiàn)腫瘤基因治療的靶向性，這方面的初步研究結(jié)果展示了令人鼓舞的前景，本研究采用基因工程方法構(gòu)建了hTERT啟動子調(diào)控自殺基因HSV-TK的腫瘤細胞特異性表達載體，以探討hTERT啟動子作為肺癌靶向性基因治療中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的可能性。
1 材料和方法
1．1 實驗材料
1．1．1 細胞
人肺腺癌細胞株A549和人胚肺成纖維細胞株MRC-5分別引自中國醫(yī)學科學院上海細胞庫和中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
1．1．2 質(zhì)粒
含SV40啟動子和增強子的熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-Control，由四川大學華西醫(yī)院感染性疾病中心唐紅教授惠贈：含TK基因的質(zhì)粒PCDNA3-TK由四川大學華西醫(yī)院車國衛(wèi)博士惠贈，含1083bp的hTERT啟動子的質(zhì)粒pGL3-hTp由本課題組在前一階段研究中構(gòu)建。
1．1．3 主要試劑
限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Xba I、PCR試劑盒、RT-PCR試劑盒及DNA連接試劑盒DNA LigationKit Ver.2.1均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品：脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol以及RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基均為Invitrogen公司產(chǎn)品；TK基因PCR引物由北京賽百盛公司合成；細胞基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒及PCR反應(yīng)產(chǎn)物回收純化試劑盒均購自北京賽百盛公司。
1．2 實驗方法
1．2．1 PCE擴增TK基因
以質(zhì)粒PCDNA3-TK為模板擴增TK基因，TK基因上游引物序列為：5'CCCAAG CTTM CGC GTATGG cTr CGT AC 3'，下游引物序列為：5'CCCTCT AGA CCG GTA TrG TCT CCT TC 3'，上下游引物5′端分別帶有HindⅢ、Xba I的酶切位點(用下劃線標示)；PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃7min，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物6μL電泳，并送大連寶生物工程有限公司作DNA測序。
1．2．2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。
質(zhì)粒pGL3-hTp和pGL3-control作HindⅢ/XbaI雙酶切，用膠回收方法回收酶切產(chǎn)物中去除lu-ciferase基因片段的載體片段(分別約4.2kb和3.6Lb)，并與PCR擴增的TK基因的HindⅢ/XbaI雙酶切產(chǎn)物作連接反應(yīng)(圖1，2)；反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109，用氨芐青霉素篩選陽性菌落，擴增，提取質(zhì)粒，采用單酶切(HindⅢ)、雙酶切(HindⅢ/XbaI)和PCR方法鑒定。
1．2．3 轉(zhuǎn)染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTD-TK的細胞A549和MRC-5中TK基因表達的檢測
對數(shù)生長期的A549和MRC-5細胞，用脂質(zhì)體法分別瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGL3-SV40-TK(陽性對照組)、pGL3-hTp-TK(實驗組)和pGL3-hTp(陰性對照組)，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000操作說明進行，72h后，提取DNA和RNA，并用PCR和R7-PCR方法檢測各轉(zhuǎn)染細胞中TK基因的存在和表達情況。
2 結(jié)果
2．1 TK基因的PCR產(chǎn)物電泳鑒定及DNA測序結(jié)果
電泳顯示，TK基因長度約1.1kb(圖3)；DNA測序結(jié)果與GenBank中TK基因序列完全一致(Ac- cession NP_044624)，長度為1131bp(圖4)。
2．2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重組質(zhì)粒的鑒定
HindⅢ單酶切顯示，pGL3-hTp-TK長度為5.4kb，pGL3-SV40-TK長度為4.8kb；兩種質(zhì)粒HindⅢ／Xba I雙酶切均在1.1kb位置出現(xiàn)DNA條帶(TK基因)，以兩種重組質(zhì)粒為模板，PCR均擴增出廠K基因片段(圖5和圖6)。
2．3 轉(zhuǎn)染細胞中rx基因表達的檢測結(jié)果
轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pGL3-h7p-TK和pGL3-SV40-TK的細胞株A549和MRC-5基因組DNA，PCR均擴增出TK基因(圖7)，說明pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK均成功轉(zhuǎn)入A549和MRC-5細胞：TK-PCR實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5細胞均有TK mRNA表達，轉(zhuǎn)染pGL3-hTp-TK的細胞中，A549有TK mRNA表達，MRC-5無TK mRNA表達；轉(zhuǎn)染pGL3-hTp的A549和MRC-5細胞均無TKmRNA表達(圖8，9)。
3 討論
自殺基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領(lǐng)域之一，也是目前最有可能有效應(yīng)用于臨床的腫瘤基因治療策略之一，自殺基因是來源于病毒或細菌的一些藥物酶基因，如果將他們導人腫瘤細胞，
其表達產(chǎn)物可以將某些無毒或低毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性藥物，影響腫瘤細胞的DNA合成，導致細胞損傷，單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因是最具代表性的自殺基因，HSV-TK可以使核苷類似物如更昔洛韋，阿昔洛韋等磷酸化，生成環(huán)腺苷一磷酸，后者可以被細胞自身的激酶進一步磷酸化成為三磷酸鹽，這些三磷酸鹽通過DNA多聚酶α加入到DNA復制過程中，可導致DAN復制鏈終止及誘導DNA單鏈斷裂，在體外實驗和動物模型研究中，HSV-TK/GCV系統(tǒng)對多種腫瘤都顯示了令人鼓舞的治療效果；HSV-TK/GCV系統(tǒng)也是目前少數(shù)進行了Ⅲ期臨床試驗的腫瘤基因治療方案之一，然而，由于HSV-TK/GCV的治療作用缺乏腫瘤特異性，可能對正常細胞也具有損傷作用，Herraiz等的動物實驗顯示，HSV-TK/CCV有導致嚴重肝損害的可能，實現(xiàn)基因治療作用的腫瘤細胞靶向性，對提高自殺基因治療方法安全性及其臨床應(yīng)用具重要意義。
關(guān)鍵詞： 辯論 基因工程 教學設(shè)計
1.教學目標設(shè)計
1.1學習需要分析
通過本節(jié)“基因治療”的學習可以加深理解基因工程的一般過程。需要進一步給學生滲透“STS”的教育理念，理解科學、技術(shù)、社會的相互關(guān)系，樹立科學的世界觀和價值觀。學生通過基因工程正負兩方面的影響，形成哲學中的“矛盾”思想，通過對“轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題”的辯論，進一步提高生物科學素養(yǎng)。
1.2教學內(nèi)容分析
“基因工程的應(yīng)用”是建立在第一節(jié)“基因工程概述”基礎(chǔ)上的?；蚬こ踢@種現(xiàn)代的生物科技是一把雙刃劍，本節(jié)內(nèi)容是從基因工程的有利應(yīng)用和可能的負面影響兩個方面闡述。本節(jié)內(nèi)容的安排有承上啟下的作用。
1.3教學對象分析
學生已經(jīng)具備遺傳學基礎(chǔ)，對基因工程的概念初步了解，初步掌握基因工程的常用工具和一般過程。課前已經(jīng)組織學生從報紙、雜志、網(wǎng)絡(luò)等媒體收集基因工程研究熱點、發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景等。學生開闊了視野，增強了科技意識，對于“長期食用轉(zhuǎn)基因豆油是否有利于身體健康”這一問題分為正反兩方。先收集資料，課堂上再進行辯論，兩方學生各選出辯手：一辯、二辯、三辯、四辯。
1.4教學目標編制
知識目標：舉例說出基因工程在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用;舉例說出生物武器的危害;收集“轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題”相關(guān)資料。
能力目標：形成收集信息、分析和處理信息的能力。
情感與價值觀目標：關(guān)注基因工程的發(fā)展，認同基因工程的應(yīng)用促進生產(chǎn)力提高;關(guān)注轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題，培養(yǎng)科技意識。
1.5教學重點的把握、教學難點的預測
本單元教學重點：基因工程在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用。
預測教學難點：學生形成收集信息、分析和處理信息的能力。
2.教學策略設(shè)計
2.1教學準備
課前準備：導學案、多媒體課件、辯手準備的辯論稿件。
課時安排：一課時。
2.2教學過程
2.2.1導入新課，激發(fā)興趣。展示“轉(zhuǎn)基因雞”耕地的圖片，投影：恐龍雞是利用一種“逆向基因工程”技術(shù)，復蘇現(xiàn)代家雞體內(nèi)沉睡的“恐龍基因”，從而讓雞“退化”成一半像恐龍、一半像雞的恐龍雞。學生小組討論：理論上如何創(chuàng)造出“恐龍雞”，幾個組代表發(fā)言，說出本組討論結(jié)果。設(shè)計意圖：激發(fā)學生的學習興趣，提高學生的想象力、創(chuàng)造力。
2.2.2基因工程的應(yīng)用。教師組織學生獨立完成前置測評題，在學生做完題之后，公布答案，安排學生自主批改。教師在統(tǒng)計正誤的基礎(chǔ)上，對學生的認知基礎(chǔ)誤差予以矯正，鞏固上節(jié)課所學的重點內(nèi)容。引入本節(jié)所學新課：（1）舉例說出動物基因工程的應(yīng)用。（2）能舉例說出植物基因工程的應(yīng)用。（3）什么是基因診斷？什么是基因治療？（4）基因治療ADA基因缺陷癥的過程包括哪些主要步驟？組織學生進行學習小組討論：“如何治療鐮刀形細胞貧血癥？”投影學生討論后的書面結(jié)果;組織學生進行班級交流，通過師生點評的方式，進一步完善學生的學習結(jié)果。學生活動：閱讀課本21、22、23頁的圖及相關(guān)文字，舉例說出動物、植物基因工程的應(yīng)用，明確基因診斷、基因治療的定義。閱讀課本24頁的圖1至12及相關(guān)文字，說出ADA基因缺陷癥基因治療過程。學習小組內(nèi)先“兵”教“兵”，各組掌握不太好的學生展示書面結(jié)果，組間同學評價。設(shè)計意圖：通過基因治療過程的學習，加深理解基因工程的操作過程。學生能模仿“基因治療ADA基因缺陷癥的過程”，說出治療鐮刀形細胞貧血癥的過程，給學生滲透“STS”的教育理念，理解科學、技術(shù)、社會的相互關(guān)系。
2.2.3轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題。投影轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)的食用油、非轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)的食用油。組織辯論賽：長期食用轉(zhuǎn)基因豆油是否有利于身體健康？評委成員：四位高三生物教師和兩位語文老師。正方：有利于身體健康。反方：不利于身體健康。組織學生依次進行立論階段、駁立論階段、質(zhì)辯環(huán)節(jié)、自由辯論、總結(jié)陳詞。八位辯論賽手進行比賽，其余學生分為正反兩方就座。辯手遇到太難問題時，可以求助賽手之外的同學。設(shè)計意圖：學生養(yǎng)成收集信息、分析和處理信息的能力。增強學生總結(jié)能力、語言組織能力、組內(nèi)協(xié)調(diào)、合作能力。小辯論賽結(jié)束后，生物教師和語文教師分別從生物學角度和辯論角度給予點評。
2.2.4生物武器的危害。播放視頻：2014年7月30日埃博拉疫情嚴峻已致死672人。（1）舉例說出：一些致病微生物的危害與控制。（2）什么是人類基因組計劃？（3）能否研制出針對特定種群（人）的生物武器，為什么？學生先組內(nèi)成員互教，后小組代表發(fā)言，其他組代表評價。設(shè)計意圖：關(guān)注時政，了解國際大事。增強人道主義教育，明確世衛(wèi)組織救援的意義。通過小組學習過程中的合作與交往，培養(yǎng)學生的協(xié)作意識與交往態(tài)度。
2.2.5教學評價。先安排學生獨立完成課本28頁的“評價指南”;然后展示答案，組織學生互改，統(tǒng)計正誤，分析誤差的原因，進行針對性矯正。根據(jù)各學習小組的積分，評選出冠軍組、亞軍組。設(shè)計意圖：檢測學生的學習情況，增強學生的集體主義榮譽感。培養(yǎng)學生撰寫綜述的能力。
【關(guān)鍵詞】 治療性疫苗；免疫應(yīng)答；研究進展
傳統(tǒng)意義上的疫苗是在健康人體中激活特異性免疫應(yīng)答， 促使機體產(chǎn)生特異性抗體及細胞毒性T淋巴細胞， 從而達到預防疾病的發(fā)生。但是， 傳統(tǒng)疫苗重在預防， 而對已發(fā)病的個體則不能誘生免疫性應(yīng)答， 也無法抵御疾病的發(fā)生。
治療性疫苗是近幾年建立并發(fā)展起來的新的免疫治療概念， 它通過改善及增強對疫苗靶抗原的攝入、表達、處理、呈遞， 激活免疫應(yīng)答， 喚起機體對靶抗原的免疫應(yīng)答能力， 達到誘導已患病個體的特異性免疫應(yīng)答， 從而實現(xiàn)清除病原體或異常細胞， 治愈疾病的作用[1]。目前， 治療性疫苗在臨床已得到越來越多的關(guān)注。本文就治療性疫苗的研究進展情況進行簡要探討。
1 治療性疫苗的種類
目前， 正在研究的治療性疫苗主要有蛋白質(zhì)復合重構(gòu)治療性疫苗、基因治療性疫苗及細胞治療性疫苗等三種。
蛋白質(zhì)復合重構(gòu)治療性疫苗是從三個方面開展對必需的靶抗原的結(jié)構(gòu)或組合， 從而達到重新喚起患者功能性免疫應(yīng)答的目的。一為在蛋白質(zhì)水平上進行修飾， 二為在結(jié)構(gòu)或構(gòu)型上加以改造， 三從組合上以多蛋白的復合及多肽偶聯(lián)等形式加以改造。
基因治療性疫苗是通過將編碼抗原質(zhì)粒直接導入機體組織中， 在注射局部表達這種抗原， 達到誘生抗原特異性體液及細胞免疫應(yīng)答?；蛑委熜砸呙缡菑捏w內(nèi)表達抗原， 并通過在空間構(gòu)象， 在抗原性上更接近于天然抗原；基因治療性疫苗可模擬體內(nèi)感染過程及天然抗原的呈遞過程；可誘生抗體特異性免疫應(yīng)答；便于操作及改造， 且生產(chǎn)周期短， 具有一定的經(jīng)濟實用性[2]。
細胞治療性疫苗是腫瘤治療性疫苗設(shè)計的熱點， 如腫瘤細胞和樹突狀細胞疫苗。腫瘤細胞中含有廣譜腫瘤抗原， 但目前仍缺乏協(xié)同刺激分子， 以識別并激活免疫細胞， 如果通過使各種輔助分子修飾腫瘤細胞或樹狀細胞， 可以有效增強細胞治療性疫苗的免疫原性， 從而達到治療的目的。
2 治療性疫苗的研究現(xiàn)狀及進展
目前， 治療性疫苗已在艾滋病、慢性乙型肝炎、腫瘤等多種疾病領(lǐng)域取得了較大的進展， 世界上首個腫瘤治療性疫苗已在古巴研制成功， 并于2008年上市；我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的乙肝免疫復合物型治療性疫苗已進入Ⅲ期臨床研究。
2. 1 腫瘤治療性疫苗 腫瘤治療性疫苗通過激發(fā)患者的自身免疫性反應(yīng)從而發(fā)揮其抗腫瘤的作用， 具有特異性強、毒性低、可產(chǎn)生持續(xù)療效等作用。
淋巴瘤治療性疫苗自第Ⅰ期臨床觀察以來， 已有20余年的時間， 但其Ⅲ期觀察結(jié)果仍沒有取得令人滿意的臨床療效， 目前尚在研究， 并不斷改善中， 目前正通過抗原傳遞的優(yōu)化、展現(xiàn)， 加強抗腫瘤T細胞功能等策略改善其臨床療效。宮頸癌的發(fā)生是由于機體感染了人瘤病毒（HPV）， 其治療性疫苗主要有多肽疫苗、樹突狀細胞疫苗、重組蛋白疫苗、重組牛痘病毒疫苗等， 部分疫苗已處于第Ⅰ期、第Ⅱ期臨床觀察中。上皮生長因子（EGF）及其受體已成為抗腫瘤的新靶標， 此外， 它還參與了惡性腫瘤的細胞生理。EGF治療性疫苗的研究在古巴取得了較大的進展， 且已通過Ⅲ期臨床觀察， 并在延長晚期現(xiàn)癌患者的生存期， 減輕副反應(yīng)等方面取得了較好的效果。
在腫瘤治療性疫苗的研究中， 采用抗原特異性免疫療法及針對DR5抗體進行治療的方式治療晚期癌癥、溶瘤病毒療法等也在研究中。
2. 2 病毒性疾病治療性疫苗 近幾年， 在慢性感染性疾病， 如乙型肝炎、丙型肝炎的治療性疫苗也取得了較大的突破。乙型肝炎免疫治療， 尤其是可消除免疫耐受， 加強特異性應(yīng)答的治療性疫苗研究在臨床上取得了較大的進展；近幾年， 我國丙型肝炎的治療性疫苗研究中， 一種通過采用多表位嵌合抗原的方法， 獲得了具有高覆蓋面的多細胞免疫抗原， 可以有效殺滅感染丙型肝炎病毒的細胞， 這也是目前處于國際同類產(chǎn)品前列的研究；還有一種新的載體HCV治療性疫苗， 它是基于高度減毒的痘病毒株MVA的T細胞誘導的治療性疫苗， 目前正在觀察不同免疫程度的效果。
2. 3 AIDS治療性疫苗 目前， 挪威科學家正在研究HIVp24樣多肽治療性疫苗， 其通過活化皮膚樹突狀細胞而誘導免疫反應(yīng)；除此之外， 科學家還嘗試采用重疊的HIV多肽融合表達， 運用樹突狀細胞的免疫療法及一些新藥物結(jié)合有維生素D3的巨噬細胞活化因素。
綜上所述， 治療性疫苗的研究歷史還比較短， 仍有許多問題正在不斷探索當中， 相信隨著研究的不斷深入， 具有潛在經(jīng)濟及社會效益的治療性疫苗的研發(fā)成功， 將會使越來越多的人們受益。
參考文獻
[1] 游丹， 劉舒媛， 楊昭慶. 治療性疫苗應(yīng)用于慢性/感染性疾病治療的研究.中國醫(yī)藥科學， 2012， 2（9）：151-155.
1.鎖核酸的化學結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)
1.1化學結(jié)構(gòu) 鎖核酸（10cked nucleic acid，LNA）也稱橋核酸，是一種化學結(jié)構(gòu)較特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，其分子結(jié)構(gòu)中含有一個或多個2’-0.4’-C-亞甲基-B-D-呋喃核糖核酸單體，核糖的2’-0位和4’-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，形似鎖狀或橋狀，這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3’-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架的局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。LNA的特殊構(gòu)象能夠?qū)е潞怂峁歉傻念A組裝，在某種程度上增加堿基堆積力，有利于雙鏈形成。
1.2理化性質(zhì) 由于LNA化學結(jié)構(gòu)的特殊構(gòu)象，其理化性質(zhì)比其他寡核苷酸具有更突出的勢：①提高與補序列的雜交高親和性：因為LNA堿基與DNA、RNA的磷酸鹽骨架相同，LNA堿基與互補序列雜交時不但具有更高親和力，而且這種相同的磷酸鹽骨架能使互補序列被LNA容易識別，從而形成高親和力的雜交物。②增加互補雙鏈的熱穩(wěn)定性：LNA單體增加到寡核苷酸鏈中時，其解鏈溫度（Tm）可明顯提高，在LNA與DNA形成的雜交雙鏈中，Tm可提高2℃-6℃，在LNA與RNA形成的雜交雙鏈中，Tm可提高3℃-9℃，可見與互補雙鏈的熱穩(wěn)定性明顯增加。③改善抗核酸酶切割能力：血液中siRNA不穩(wěn)定，極易被大量的核糖核酸酶迅速分解，在siRNA 3’末端被LNA單體修飾后，siRNA抗核酸酶切割能力和在血清中的半衰期明顯提高。④LNA的無毒性：注射反義LNA后，通過檢測小鼠血清肝腎功能生化指標和病理切片HE染色，未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。⑤LNA與DNA或RNA結(jié)合時，錯配辨別力更強。⑥LNA水溶性好，自由出人細胞，易被機體吸收。正是因為LNA所具有的這些優(yōu)勢，近年來不管是在基因診斷還是基因治療中，LNA成了學者的研究熱點。
2.LNA在抗病毒診斷中的應(yīng)用
2.1乙型肝炎病毒（HBV）檢測 在治療慢性乙型肝炎時，核苷類似物如拉米夫定（LAM）、替比夫定、阿德福韋（ADV）等被長期應(yīng)用于抗乙肝病毒（Hepatitis B Virus.HBV）治療并一定程度上抑制了病毒的復制。但是長期使用這些抗病毒藥物可使病毒基因發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥，最終引起無效治療和影響后期的康復。因此，測定先存或新形成的HBV抵抗菌株在臨床治療中對抗病毒治療方法選擇有著重要意義。目前檢測耐藥HBV一般由直接測序法完成，但是這種方法耗時，更重要的是無法同時檢測混在同一樣品中野生型和變異型的種群，因此不適合常規(guī)的臨床應(yīng)用。普通PCR擴增病毒DNA的種群測序法敏感性較低，當新形成的變異株數(shù)量較少或是中止治療后變異株降低時難以鑒別。其他的方法比如線性探針分析法，敏感性雖然比普通PCR擴增病毒DNA的種群測序法增加5%-10%，但是變異株的數(shù)量常常在它的檢測最低水平以下。建立一種靈敏、特異、準確、快速、方便的檢測方法對于慢性乙型肝炎感染者抗病毒治療中耐藥性的確定和監(jiān)測具有重要意義。有研究者構(gòu)建聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）與Real-time PCR-LNA-TaqMan探針.并用這兩種方法與直接測序法檢測拉米夫定藥物治療的乙肝患者血清HBV，實驗結(jié)果顯示，PCR-RFLP與Real-time PCR-LNA-TaqMan探針法可以檢測野生型YMDD和它的變異型YIDD和YVDD，但Real-time PCR-LNA-TaqMan探針法鑒定耗時少，更敏感。Wang Q等用同樣的方法檢測15例單純HBsAg（+）樣本，結(jié)果有4例HBsAg（+）樣本未能被普通TaqMan探針檢測出陽性，而使用LNA-TaqMan探針法檢測全為陽性。Sun z等建立TaqMan-LNA探針多重實時PCR（multiplex realtime PCR）方法鑒別野生型和突變型菌株。研究發(fā)現(xiàn)這種靈敏的方法可以定量10拷貝的HBV，能檢測10拷貝野生型HBV中存在低至1%的突變型，而且分析30例HbsAg（+）血清樣品只需要3.5小時。用等位基因特異性鎖核酸實時熒光定量PCR（RT-AS-LNA-q PCR）方法.通過序列匹配標準對變異型和野生型HBV定量，實驗中能準確檢測占總菌數(shù)水平0.1%或以下的17種不同的核苷酸變異且進行基因分型。Zeng Y等用同樣的方法檢測野生型、突變型標準質(zhì)粒時，證實了該方法線性范圍寬和檢測下限低，而且準確度高。
2.2丙型肝炎病毒（HCV）檢測 HCV病毒載量的測定是慢性丙型肝炎治療管理必不可少的一部分。常用的血清和血漿的HCV RNA定量非常耗時且試劑用量大，另外，一些存留在細胞內(nèi)如外周單個核細胞（PBMC）、冷沉淀劑、吸附在紅細胞或血小板的病毒RNA無法檢測。因此，定量血清或血漿HCVRNA往往低于總的循環(huán)病毒載量。雖然檢測存留在PBMC和全血的HCV RNA可為干擾素治療結(jié)束后預測病毒復發(fā)，然而定量分析PBMC病毒動力學只能提供微小的預測信息，而且PBMC分離、計數(shù)、洗滌程序也較為煩瑣，因此，或許全血定量HCVRNA可以作為最佳選擇。但是，尚未有研究證實是否用全血定量HCV RNA比血漿或者血清具有更高的診斷敏感性。Bruns T構(gòu)建LNA合成的核苷酸衍生物2’-0-甲基RNA（2’-ome-RNA）形成穩(wěn)定的復合物而更能抵抗核酸酶的降解，因此LNA修飾的寡核苷酸能提高RNA的提取率。從222份臨床血漿樣本，82份用LNA介導的捕獲方法提取HCV RNA，實時反轉(zhuǎn)錄PCR（real-time reverse transcription-PCR）定量，結(jié)果與試劑盒H AmpliPrep/TaqMan（CAP/CTM）HCV測試比較，這個實驗的分析敏感性為9IU/10微升樣品，線性范圍為500-5×10 IU/ml，在血漿準確測試10個HCV亞型：血漿和全血樣品檢測結(jié)果是相等的（決定系數(shù)R2=0.943）和在全血異性為100%（n=20）；敏感性在血漿濃度為95%檢測極限時全血樣品為100%（n=141）；10微升全血定量結(jié)果與HCV血漿測試結(jié)果具有相關(guān)線性（R2=0.919；n=140）。目前檢測人類肝組織HCV的方法主要有免疫組織化學、原位雜交（ISH）、原位RT-PCR，但是免疫組織化學和ISH重復性較差，原位RT-PCR雖然敏感性好，但伴隨著較高的假陽性率。為了尋找可靠診斷的組織化學技術(shù)檢測肝組織HCV，設(shè)計LNA探針I(yè)SH技術(shù)和生物素釋放信號擴增系統(tǒng)（biotin-free catalyzed signal amplification sys-tern，CSAII）檢測中嵌合體小鼠和丙肝患者肝組織HCV RNA，結(jié)果顯示陽性率分別為100%（13/13）和82%（9/11），在慢性乙肝損傷、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原發(fā)性肝癌中HCV RNA均是陰性。證明了LNA探針I(yè)SH技術(shù)簡單可靠，適用于常規(guī)細針活檢檢測丙肝患者肝臟中HCV RNA。
2.3HIV檢測 精確檢測血液中HIV DNA和RNA，o論診斷是否HIV感染，還是評估HIV病人治療后病毒載量、病毒復制的治療效果都起到重要作用。但在廣泛使用抗病毒治療的環(huán)境下，HIV-1由于基因變異產(chǎn)生了藥物抵抗，但其機制非常復雜.當產(chǎn)生藥物抵抗時需要改變治療方案。HIV的單核苷酸基因多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）給各種傳統(tǒng)的檢測方法檢測提出了難題，一方面HIV-1 M組HIV-1亞型遺傳多樣性，無法與多種變異型特異性結(jié)合，目前大多數(shù)的熒光定量PCR只適合定量HIV-1 B亞型；另一方面為使探針退火溫度達到最佳，傳統(tǒng)的Taqman探針包括25至35個核苷酸。由于HIV-1自然的異質(zhì)性，很難在200個堿基對中找到三個保守區(qū)（兩個為引物一個為內(nèi)部探針同源序列）包括所有或大部分HIV-1 M組亞型，這造成了檢測時靈敏性降低。因此需要一種靈敏、高效的實驗方法監(jiān)測HIV-1型的治療。許多學者在各種方法的基礎(chǔ)上用LNA修飾改良而使檢測的敏感性和特異性上升。因為構(gòu)建的LNA Taqman探針比普通的Taqman探針更短，與HIV-1亞型保守序列雜交的靶標也相應(yīng)變短.可以有效克服傳統(tǒng)探針的局限性，應(yīng)用于HIV-1分型中有更寬的檢測范圍、更靈敏檢測下限，可廣泛適用于HIV-1的分型。在陽性干血斑（dfled blood spots，DBS）中，HIV-1 DNA檢測靈敏度也達到了100%，結(jié)果與血漿的HIV RNA水平顯著相關(guān)（r=0.765，P
3.LNA在抗病毒基因治療中的應(yīng)用
3.1HBV基因治療 HBV是一種有包膜的嗜肝DNA病毒，目前HBV可被分為A-J共10種基因型，每種基因型又可進一步分為若干個基因亞型。流行于我國的HBV基因型主要為B和C基因型，其中，B型又以B2亞型為主，主要流行于廣西、廣東、海南等南方地區(qū)：C型主要有C1和C2兩種亞型，主要流行于我國北方地區(qū)。乙肝病毒感染可引起病毒性乙型肝炎，是一種傳染性較強的疾病，如果得不到有效控制，易發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，對人類的危害已經(jīng)成為全球性問題，而中國是重災(zāi)區(qū)之一。目前臨床上治療慢性乙型肝炎仍然缺乏特效藥物，主要應(yīng)用核苷酸類似物或干擾素等藥物抗病毒治療。這種抗病毒療法雖然在一定程度上能降低人體內(nèi)的病毒載量，但無法完全清除，因此需探索一種更有效的策略治療乙肝病毒引起的乙型肝炎?；蛑委熓墙陙淼难芯啃聼狳c，其中反義LNA做了大量的研究并取得了一定的成果。反義LNA治療，其作用原理是通過與特定的病毒mRNA結(jié)合，發(fā)揮基因“封條”或酶切割作用，使靶mRNA表達受抑制或降解，從而達到治療目的。LNA起到了增加反義寡核苷酸的熱穩(wěn)定性和親和力作用。在體外細胞實驗中利用拉米夫定抗病毒藥物與HBV S基因反義LNA對比抗病毒效果，研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定對HBV DNA抑制效果明顯，但對HBsAg、HBeAg抑制較弱，而反義LNA對這三個檢測指標都有明顯的抑制作用，效果比拉米夫定更好。鄧益斌等在細胞實驗中設(shè)計反義LNA研究其在細胞的抗病毒效果，實驗證明了對HBV DNA、HBsAg、HBeAg有強的抑制作用，且對細胞的新陳代謝無明顯影響。在體外細胞實驗中，反義LNA對HBV的復制和表達表現(xiàn)出了強抑制作用。在進一步的研究中針對HBV S、前C/C、S/C靶點設(shè)計反義LNA，并在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)驗證對HBV抑制其表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和細胞實驗一樣對HBV有明顯的抑制作用，通過實驗檢測小鼠血清肝功能和腎功能指標及肝、腎組織結(jié)構(gòu)病理檢查，與對照組相比，鎖核酸治療組的肝功能和腎功能無明顯差異，表明了鎖核酸在體內(nèi)的無毒性和安全性。單靶區(qū)和雙靶區(qū)對HBV都有較強的抑制作用，但雙靶區(qū)抑制效果明顯高于單靶區(qū)，證實了聯(lián)合多位點設(shè)計的反義LNA能更有效抑制HBV。這些研究都證明了HBV的反義治療是有效的，不過由于反義治療的作用位點是mRNA，雖然一定程度上能抑制HBV的生成，但是并沒有從源頭抑制HBV DNA，其可以不斷地表達。因此提出抑制HBV DNA的反基因治療可能獲得更大的抑制效果。反基因治療是由外源特定寡聚脫氧核苷酸與病毒雙鏈DNA的特定區(qū)域?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，形成三鏈DNA分子，從而阻斷靶基因的復制與轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)“反基因”之目的。在國內(nèi)對反基因LNA治療HBV有了初步研究.Y.-B.Deng等針對乙肝病毒S基因同聚嘌呤區(qū)設(shè)計反基因鎖核酸細胞實驗，研究對HBV的抑制和表達，實驗結(jié)果表明，該實驗對HBV具有明顯的抑制能力。Sun z等在實驗中證明了通過脂質(zhì)體介導的反基因LNA能有效地穿過細胞核與靶HBV DNA發(fā)生特異結(jié)合而抑制其復制表達，抑制能力比反義LNA與pgRNA的抑制作用更強，顯示出了反基因具有更強大的抑制能力和發(fā)展空間。但是目前的研究只是在細胞實驗中進行，是否在體內(nèi)一樣具有抑制作用和安全性有待進一步的研究。
3.2HCV基因治療 丙型肝炎是HCV引起的一種傳染性疾病，其傳播途徑主要是通過血液進行傳播，急性感染者有70%-85%可發(fā)展為慢性丙型肝炎，如果得不到有效治療，長期發(fā)展可能轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?、肝癌。因為丙型肝炎及其引發(fā)并發(fā)癥每年造成的死亡人數(shù)為35萬-50萬。HCV在分類中屬于單股正鏈RNA病毒，由5’非編碼區(qū)（5’NCR）、結(jié)構(gòu)區(qū)（C、E區(qū)）、非結(jié)構(gòu)區(qū)（NS區(qū)）和3’非編碼區(qū)共4個區(qū)域組成，其中5’非編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)C區(qū)的序列非常保守。5’NCR中的內(nèi)源性核糖體進入位點（internal ribosome entry site.IRES）是HCV基因組中的翻譯起始位點，是HCV復制所必需的元件之一，其在病毒基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。Christopher J.Nulf等針對IRES設(shè)計反義鈦核酸（peptide nucleic acid，PNA）和反義LNA與IRES序列關(guān)鍵位點結(jié)合以達到阻斷翻譯的目的，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PNA和LNA都能有效地侵入HCV IRES的重要序列并阻斷翻譯。而Carl Laxton等在研究中不僅證明了反義LNA的有效抗病毒活性，半衰期長（>5天），到達肝最大濃度>100倍體外抗病毒活性所需的濃度，而且也驗證了其低的細胞毒性。近年來，在脫氧核酶的兩條結(jié)合臂上增加LNA而形成的鎖核酸核酶（LNAzyme）切割破壞IRES和C基因抑制病毒基因的表達也取得了一定的進展。針對HBV 5’非編碼區(qū)合成LNAzyme、硫代DNAzyme、DNAzyme三種核酶，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種核酶中，LNAzyme對HCV RNA復制和熒光素酶基因表達具有更強的抑制作用，且隨用藥時間延長，抑制率呈增高趨勢，用四甲基偶氮唑藍（MTT）法監(jiān)測細胞活性未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。另一研究中觀察雙基因靶位和單基因靶位抑制作用時，結(jié)果HCV RNA和熒光素酶的抑制率在各組中分別為：單靶區(qū)NCR組62.12%，66.49%；單靶區(qū)C組61.39%，65.06%；雙靶區(qū)NCR/C組75.37%，73.30%，結(jié)果表明了雙基因靶位的抑制率優(yōu)于單基因靶位。微小RNA（microRNA，miRNA）由21-25個核苷酸組成，屬于非編碼RNA。肝臟中含有大量的miRNA.而miR-122是含量最多的一種.約占肝臟所有miRNA總量的72%。miR-122對肝臟的正常功能和分化調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用，但在丙型肝炎患者中大量表達，能促進HCV的復制和蛋白的表達。Miravirsen（SPC3649）是一種由LNA修飾的硫代反義寡核苷酸治療藥物，它的作用原理是與miR-122發(fā)生特異性結(jié)合，并且形成高度穩(wěn)定的雜交雙鏈，阻斷miR-122對HCV的調(diào)節(jié)，最終抑制HCV的復制。最近報道，SPC3649通過結(jié)合pri-和pre-miRNAs的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)而抑制miR-122的生物活性。最初實驗用antagomir-122，miR-122ASO，LNA修飾的寡核苷酸在鼠體內(nèi)進行，結(jié)果三組都有效地減少肝臟miR-122水平和血清膽固醇水平，并未觀察到毒性效應(yīng)。在這些ASO中，LNA高親和力修飾寡核苷酸（SPC3649）對miR-122抑制能力最強。因此SPC3649隨后進一步在靈長動物上研究其安全性和效果。SPC3649的安全性測試在獼猴身上研究，顯示可以降低血清總膽固醇并有劑量依賴性，無嚴重毒性作用，證明了miR-122抑制藥物沒有影響肝的形態(tài)和功能。HCV慢性感染的黑猩猩用SPC3649治療顯示長期抑制HCV復制而沒有副作用。隨著臨床前研究的成功完成，SPC3649進入人類臨床試驗。第1階段的研究數(shù)據(jù)表明SPC3649有好的耐受性和劑量限制毒性，減少血清膽固醇水平。第2a階段臨床研究，評估多劑量SPC3649治療miR-112安全性、耐受性、藥物代謝動力學、療效，研究發(fā)現(xiàn)，SPC3649具有廣泛的抗病毒活性，有劑量依賴性和持續(xù)減少血清膽固醇和HCVRNA水平，并且未觀察到HCV基因組中存在mir-122結(jié)合位點的病毒抵抗，也未發(fā)現(xiàn)劑量限制性的不良反應(yīng)事件。SPC3649比其他抗HCV藥物有幾個優(yōu)點，不像大多數(shù)抗病毒藥直接作用于HCV，而是作用于miR-112能避免由于HCV基因組突變引起的藥物抵抗。
3.3HIV基因治療 自從高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy，HAART）被用于臨床治療艾滋病以來.雖一定程度上抑制患者HIV-1并改善病程發(fā)展，但是長期HAART會導致病毒耐藥和突變等問題，從而使治療艾滋病的效果逐漸下降。目前應(yīng)用于HIV-1基因治療的策略主要包括反義RNA、RNA適體、核酶、RNA干擾、RNA誘餌和一些基于蛋白的抑制劑。LNA被應(yīng)用這些治療方法中是為了增加靶向性和穩(wěn)定性而增強抑制HIV-1作用。有研究比較反義DNA、反義LNA、LNA核酶、DNA核酶在細胞培養(yǎng)中阻斷HIV-1 RNA模板反轉(zhuǎn)錄和二聚作用的生物活性并抑制HIV-1生成，結(jié)果證明抑制HIV-1表達能力：反義LNA>LNA核酶>DNA核酶>反義DNA。Elmen J等在HIV-1保守區(qū)二聚作用起始位點（dimerization initiation site，DIS）應(yīng)用反義LNA提高了抑制HIV-1的性能。另有研究鳥嘌呤-四聯(lián)體序列5’-TGGGAG和17-mer序列T30177利用LNA修飾后抗HIV-1活性提高8倍。HIV-1反式激活應(yīng)答元件（TAR）RNA59殘基莖，環(huán)結(jié)構(gòu)干擾HIV反式激活蛋白Tat和其他細胞因子刺激病毒長末端重復（long terminal repeat，LTR）的轉(zhuǎn)錄延長，從而達到阻斷全長的艾滋病毒轉(zhuǎn)錄和復制的目的。研究中發(fā)現(xiàn)長度相同（12個殘基）的2’-0-甲基寡核糖核苷酸（2’-O-methyl oligoribonucleotide，OMe）、OMe/LNA、PNA都同強度與TAR結(jié)合并抑制HIV-1轉(zhuǎn)錄。此外，當通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細胞.發(fā)現(xiàn)3’-羧基熒光素標記的12-mer OMe/LNA嵌合寡核苷酸可抑制特定序列。另有報道發(fā)現(xiàn)OMe寡核苷酸與40%-50%LNA（包括a-L-LNA or 29-硫代-LNA）雜合效果最佳，且長度不能低于12殘基。LNA應(yīng)用于HIV-1基因治療方法中還有RNA適體。適體（aptamer）是奶逋夤押塑賬嶸稈〉哪芙裘芙岷習蟹腫擁囊歡DNA或RNA。適體與RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)通過環(huán)一環(huán)相互作用相互影響.被稱為識別RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的另一種反義寡核苷酸。其在抗HIV-1的應(yīng)用研究多用于與反轉(zhuǎn)錄病毒蛋白Tat的肽競爭結(jié)合于TAR，即使兩個配體的結(jié)合位點不重疊。一旦結(jié)合，適體TAR采用合適構(gòu)象不再適合與Tat產(chǎn)生聯(lián)系，最終抑制HIV-1。相對比，反義LNA雖與適體都具有較強的結(jié)合力和堿基配對潛能，但不能競爭于Tat。更重要的是我們發(fā)現(xiàn)LNA/DNA適體結(jié)合于TAR的特異性比LNA/DNA反義寡核苷酸高。
摘要
神經(jīng)細胞的特化之一是其軸突，長度可達胞體直徑的幾百甚至幾千倍．軸漿轉(zhuǎn)運維系著胞體和軸突終末之間大量的物質(zhì)交流，保證神經(jīng)細胞發(fā)揮正常功能．軸漿轉(zhuǎn)運障礙可以導致神經(jīng)細胞功能受損直至凋亡．在一些視神經(jīng)疾病中，軸漿轉(zhuǎn)運功能的改變是最早出現(xiàn)的癥狀，因此也可能成為治療的潛在靶點．在青光眼和視神經(jīng)缺血的動物模型中，軸漿轉(zhuǎn)運功能的下降是最早出現(xiàn)的變化之一．而Leber's遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)和常染色體顯性視神經(jīng)萎縮(ADOA)是已知線粒體功能障礙引起的視神經(jīng)疾?。浑y想象，長距離軸漿轉(zhuǎn)運功能對能量代謝尤其敏感，因此在LHON和ADOA中可能也有不同程度的下降，但似乎并沒有受到足夠關(guān)注．本文首先回顧了微管和馬達蛋白在軸漿轉(zhuǎn)運中的作用，比較分析以上所述幾種疾病的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)及治療手段，試圖發(fā)現(xiàn)它們之間的共同特點以及這些特點與能量代謝、軸漿轉(zhuǎn)運之間的潛在關(guān)系，為其治療提供新的思路．
關(guān)鍵詞
視神經(jīng)疾病，青光眼，Leber's遺傳性視神經(jīng)病變，常染色體顯性視神經(jīng)萎縮，能量代謝，軸漿轉(zhuǎn)運
神經(jīng)元是一種極化細胞，即它具有樹突、胞體和軸突．細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸是其進行生命活動的基本功能之一，而神經(jīng)元軸突相對胞體極大的長度，對細胞器和蛋白質(zhì)以及其他物質(zhì)在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運形成了一定的挑戰(zhàn)．細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸依賴微管和馬達蛋白．視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是視網(wǎng)膜的輸出元件，它的軸突組成視神經(jīng)，在一些視覺系統(tǒng)疾病中，視神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運可能也會是易感環(huán)節(jié)．在青光眼中，有大量研究表明軸漿轉(zhuǎn)運功能障礙的出現(xiàn)遠早于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的死亡．軸漿轉(zhuǎn)運是一個耗能的過程，對青光眼模型的研究表明，軸漿轉(zhuǎn)運障礙可能與線粒體功能受到各種影響而發(fā)生異常有關(guān)．這使我們聯(lián)想到Leber's遺傳性視神經(jīng)病變和常染色體顯性視神經(jīng)萎縮這兩種已明確的線粒體異常引起的視神經(jīng)疾病中軸漿轉(zhuǎn)運可能也會發(fā)生異常．我們比較分析了這幾種疾病的病因、癥狀及治療方法，試圖發(fā)現(xiàn)提高能量代謝水平或重塑軸漿轉(zhuǎn)運功能的方法，為這些疾病的治療提供新思路．
1軸漿轉(zhuǎn)運
細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器的運輸是進行生命活動的最基本功能之一，對神經(jīng)元尤為重要．因為神經(jīng)元擁有一個獨特的結(jié)構(gòu)———軸突，其長度可達胞體直徑的幾千倍．很多蛋白質(zhì)和細胞器需要從胞體運輸?shù)捷S突及其終末，而軸突終末從靶位置攝取的某些物質(zhì)，也需要運輸?shù)桨w發(fā)揮作用，有些甚至可以影響細胞存活．細胞的物質(zhì)運輸系統(tǒng)由微管和馬達蛋白組成．微管是由13個原絲聚合形成的中空的管狀結(jié)構(gòu)，每個原絲都是由結(jié)構(gòu)相似的球蛋白α、β微管蛋白(α-，β-tubulin)異二聚體組合成的．其聚合和水解較快的一端被稱為正極，另一端則為負極．正極分布于細胞外周，負極則集中在細胞核附近的中心粒．由于微管蛋白結(jié)合的鳥苷酸可以有二磷酸或三磷酸的形式，所以微管蛋白在一定條件下會表現(xiàn)出動態(tài)不穩(wěn)定(dynamicinstability)，即微管蛋白的一端會在延伸和縮短之間轉(zhuǎn)換．在神經(jīng)細胞的軸突中，微管的排列方向與胞體內(nèi)是一致的：正極朝向突觸終末而負極朝向胞體．微管是軸漿轉(zhuǎn)運的軌道，微管蛋白的翻譯后修飾能形成更為穩(wěn)定的微管結(jié)構(gòu)．Hammond等[1]認為微管的動力學特性主要是由微管蛋白的翻譯后修飾等引起．2010年，Janke和Kneussel[2]發(fā)現(xiàn)，在成熟穩(wěn)定的軸突中富含乙?；摩?tubulin，它們與微管的穩(wěn)定相關(guān)．2012年，Cho等[3]也發(fā)現(xiàn)在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的軸突損傷處乙酰化的神經(jīng)微管蛋白明顯減少．
與微管結(jié)合的馬達蛋白有2種：驅(qū)動蛋白(kinesins)家族和動力蛋白(dyneins)家族．驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)與肌球蛋白(myosinⅡ)相似，由2條重鏈和2條輕鏈組成．重鏈的頭部是球型馬達結(jié)構(gòu)域，尾部由2條重鏈組成二聚體．驅(qū)動蛋白超家族擁有至少10個家族．大多數(shù)成員的馬達域在N端，向微管的正極運輸，而一些成員的馬達域在C端，向微管的負極運輸．驅(qū)動蛋白的運輸速度在2～3mm/s．動力蛋白家族則負責向微管的負極運輸．軸漿轉(zhuǎn)運中涉及的是胞漿動力蛋白(cytoplasmicdyneins)．它們通常是重鏈的同二聚體，有2個大的馬達域構(gòu)成的頭部，運輸速度可達14mm/s．動力蛋白本身就是一個大的蛋白質(zhì)復合體，在運送細胞器時，它們還需要和另一個大的復合體動力蛋白激活蛋白(dynactin)形成復合體．根據(jù)物質(zhì)運輸?shù)乃俣?，軸漿轉(zhuǎn)運可分為快速運輸和慢速運輸．我們對軸漿轉(zhuǎn)運速度的認識多來自于經(jīng)典的脈沖追蹤術(shù)，這種方法用于多種動物的在體研究，發(fā)現(xiàn)一部分被標記的蛋白(膜性細胞器和膜蛋白)運動速度較快，為50～200mm/d，細胞骨架蛋白如微管蛋白、神經(jīng)纖維絲以及成百上千種可溶的或胞漿蛋白如代謝酶、熱休克蛋白、馬達蛋白等這些蛋白運動速度很慢，為0.2～10mm/d，其中微管蛋白和神經(jīng)纖維絲速度最慢，為0.2～1mm/d．現(xiàn)普遍認為快速運輸是由驅(qū)動蛋白和動力蛋白負責的順向轉(zhuǎn)運和逆向轉(zhuǎn)運組成．慢速轉(zhuǎn)運多為順向運輸，也有極少的逆向轉(zhuǎn)運被報道．最經(jīng)典的研究是Fink和Gainer[4-5]將軸突中間標記，之后觀察到慢速運輸向兩個方向進行．之后又有動力蛋白參與慢速運輸?shù)南嚓P(guān)報道[6-7]．一些研究表明，無論是快速運輸還是慢速運輸，都是由分子馬達參與的，之所以后者速度慢，是因為其在運動過程中存在長時間的停頓[8-9].當然，慢速運輸?shù)臋C制比快速運輸復雜得多，而且可能不止上述一種[10]．
2視神經(jīng)疾病及其與軸漿轉(zhuǎn)運障礙的可能關(guān)系
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是視網(wǎng)膜的輸出元件，以動作電位編碼光刺激，通過其軸突，即視神經(jīng)將其信號傳至更高級的視覺中樞．絕大部分的視神經(jīng)投射至丘腦外側(cè)膝狀體，換元后投射至初級視皮層，為成像作貢獻．大部分的軸突亦有分支投射至中腦上丘，控制眼動．另有一些節(jié)細胞投射至下丘腦、中腦等一些核團，控制瞳孔反射、晝夜節(jié)律等非成像視覺功能．視神經(jīng)病變，如青光眼、Leber's遺傳性視神經(jīng)病變及常染色體視神經(jīng)萎縮等，它們病程最終的結(jié)果都是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退化從而致盲．
2．1青光眼青光眼是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲疾?。喙庋凼怯芍饕L險因子眼內(nèi)壓的升高[11]或其他多因素導致的以視凹陷、視盤受損后周邊神經(jīng)纖維層變薄、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退行性病變、視功能進行性損害為主要特點的慢性進展性疾?。喙庋弁ǔ１环譃殚_角型青光眼和閉角型青光眼兩類．前者起病時并無明顯癥狀，早期患者視力并無明顯損害，隨著疾病的逐漸發(fā)展，視盤周圍神經(jīng)纖維進一步丟失，患者視野表現(xiàn)為進行性縮小，疾病終晚期患者視力喪失．閉角型青光眼則為急性發(fā)作，有眼壓增高及疼痛．少數(shù)患者表現(xiàn)為以視黃斑束最先損害的中心視野缺損．兩種類型青光眼最終均可致盲．青光眼病因復雜且尚無定論．轉(zhuǎn)基因動物DBA/2J小鼠中部分動物眼壓隨年齡上升，較好地模擬了人類開角型青光眼．2008年，Buckingham等[12]的研究表明：3月齡時小鼠眼壓上升；6月齡時，軸漿轉(zhuǎn)運熒光金的功能開始下降；12月齡時軸突斷裂；18月齡時細胞體固縮，凋亡．Dengler-Crish等[13]在2014年也在DBA/2J的小鼠模型中討論了軸漿順向運輸和逆向運輸障礙發(fā)生的關(guān)系問題，他們發(fā)現(xiàn)在9～10月齡的小鼠中，CTB標記的上丘面積的減少較熒光金標記的節(jié)細胞數(shù)量的減少更甚，表明軸漿順向運輸障礙要比逆向運輸障礙更為嚴重．在青光眼中，也有多項研究顯示與軸漿轉(zhuǎn)運相關(guān)的馬達蛋白確實出現(xiàn)異常．2006年，Martin等[14]采用了一個激光灼燒房水流出區(qū)域造成房水循環(huán)受阻的慢性青光眼大鼠模型，他們發(fā)現(xiàn)在眼壓升高3天后，視神經(jīng)處72ku的動力蛋白中間鏈就發(fā)生積累．在急性高眼壓模型中，將眼壓升至較高水平時，熒光金標記的大鼠視神經(jīng)軸漿的逆向轉(zhuǎn)運功能明顯下降[15]，而眼壓升至40～50mmHg時，大鼠逆向轉(zhuǎn)運功能先下降，不過在一周后又恢復至正常水平[16]．普遍認為青光眼中視神經(jīng)是軸漿轉(zhuǎn)運最早發(fā)生障礙的部位[17-21]．2011年，Chidlow等[22]發(fā)現(xiàn)，在慢性激光灼燒小梁網(wǎng)的慢性青光眼模型中，視神經(jīng)處蛋白的積累早在模型后8h就已發(fā)生，且在24h蛋白的積累達到頂峰．但近來也有研究顯示軸突遠端先受影響[23]．何士剛實驗室長期觀察了急性視網(wǎng)膜缺血模型后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸漿轉(zhuǎn)運功能，軸突連續(xù)性及視功能的變化，證實了軸漿轉(zhuǎn)運功能的下降早于軸突連續(xù)性的變化，并且軸漿轉(zhuǎn)運功能的下降與視銳度和反差靈敏度測試表征的視功能下降有很強的相關(guān)性．我們發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)視功能障礙即進行治療，視功能便可基本恢復至正常狀態(tài)[15]．這些證據(jù)表明，早期的視功能下降，可能包括早期的視野缺失，并非完全是不可逆的．恢復了軸漿轉(zhuǎn)運，就有可能逆轉(zhuǎn)視功能的下降．有研究表明，青光眼的發(fā)生及視覺喪失與線粒體功能障礙有關(guān)[24-25]．眼內(nèi)壓升高會使視網(wǎng)膜處于供血不足的狀態(tài)，導致線粒體功能受損[26]．視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的線粒體作為獨立的部件，通過軸漿快速轉(zhuǎn)運，從胞體運輸至軸突末梢[27-28]．這個過程是由驅(qū)動蛋白和微管介導的，需要ATP的參與．在大鼠中，線粒體的生命周期一般為3周[29]．一旦能量代謝異常，會影響線粒體在節(jié)細胞中的運輸，進而造成惡性循環(huán)，更嚴重地影響能量代謝和軸漿轉(zhuǎn)運．2015年，Takihara等[30]發(fā)現(xiàn)：在4月齡的慢性青光眼模型小鼠上，節(jié)細胞死亡之前軸漿轉(zhuǎn)運線粒體的數(shù)量就已經(jīng)減少，但線粒體的其他轉(zhuǎn)運指標，如持續(xù)時間、轉(zhuǎn)運距離和工作周期等均未發(fā)生變化；到23～25月齡時，轉(zhuǎn)運線粒體的時間、距離及工作周期均有下降．青光眼發(fā)病和進展隨年齡增長而增長，這可能也和線粒體隨著年齡的增長所出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和功能的退化相關(guān)．比如氧化磷酸化能力減弱、活性氧的產(chǎn)生增加、線粒體DNA的突變增多等等．因為視神經(jīng)中含有豐富的線粒體，對這些變化可能尤其敏感，而視神經(jīng)的損害，進而會影響視覺功能[25]．最初治療青光眼的目標主要是降低眼內(nèi)壓．使眼壓下降20%～40%能夠?qū)⒁曇叭笔У乃俣葴p半[31-32].最早降眼壓的滴眼液于1875年問世，目前常用的降眼壓藥物主要為β受體阻斷劑、碳酸酐酶抑制劑、前列腺素類似物、α2腎上腺素受體激動劑、擬副交感神經(jīng)藥物等．除了單一成分的滴眼液之外，也存在一些復合制劑．以上這些滴眼液可以減少房水的形成或增加其排出．不過由于青光眼病因不明，也可能是視神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運障礙造成的神經(jīng)營養(yǎng)因子的運輸障礙[33]，以致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子(尤其是腦源性營養(yǎng)因子BDNF和神經(jīng)生長因子NGF)而死亡[34-35]．例如，2000年P(guān)ease等[36]發(fā)現(xiàn)在急性高眼壓的猴子和大鼠的視神經(jīng)處BDNF及其受體TrkB都有積累．因此，通過直接或基因治療方式在視網(wǎng)膜中施加神經(jīng)營養(yǎng)因子，保護神經(jīng)細胞及改善能量代謝和軸漿轉(zhuǎn)運功能[15,37-38]，可能也不失為治療青光眼的策略之一．
2．2常染色體顯性視神經(jīng)萎縮(ADOA)常染色體顯性視神經(jīng)萎縮(ADOA)也叫做Kjer's視神經(jīng)萎縮，因丹麥的眼科醫(yī)生Kjer發(fā)現(xiàn)了19個ADOA家族而得名，其遺傳遵循孟德爾遺傳法則．隨后在英國、美國和法國又有大的家族被報道患有該?。餉DOA的基因OPA1直到2000年才被發(fā)現(xiàn)[39-40]，是由染色體3q28的核DNA編碼，而該基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物靶向線粒體發(fā)揮功能，其線粒體損傷致疾病的本質(zhì)才完全被證明．ADOA在全世界的患病率達3/100000，在丹麥，它的發(fā)病率更是高達1/10000[41]．該病發(fā)病較早，在兒童時期就已發(fā)?。瓵DOA在發(fā)病初期沒有明顯癥狀，且多為雙側(cè)視神經(jīng)病變．患者一般會經(jīng)歷緩慢的疾病惡化過程———視力逐漸退化．在個別成人中也有視力急劇下降的報道．眼底檢查發(fā)現(xiàn)在視盤顳側(cè)有雙邊對稱的白色區(qū)域，說明匯聚至視神經(jīng)軸突的神經(jīng)纖維確實減少．ADOA視野的丟失從中央開始，ADOA患者還有視敏度下降、色覺受損等癥狀．有一小部分患者會有一些額外的臨床表現(xiàn)，如神經(jīng)性耳聾、進行性眼外肌麻痹、共濟失調(diào)和肌肉病變等[42-43]，被稱為ADOA+．截至目前，已發(fā)現(xiàn)3個與ADOA相關(guān)的基因：OPA1、OPA3和OPA7，均編碼線粒體內(nèi)膜上的蛋白．OPA1編碼的蛋白是動力蛋白相關(guān)的鳥苷三磷酸酶，該蛋白在線粒體融合和細胞色素C的釋放中發(fā)揮重要作用[44]，并作為一個關(guān)鍵蛋白在線粒體動力學網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用．線粒體的動力學是指線粒體沿細胞骨架的運動以及線粒體形態(tài)的變化，由融合和分裂控制，其正常進行能保證線粒體正確選擇形成管狀結(jié)構(gòu)還是網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)．OPA1基因編碼的蛋白能確保內(nèi)膜的融合，它分布于膜間隙、內(nèi)膜和線粒體的嵴上，另外，OPA1還能在興奮性毒性的環(huán)境下促進神經(jīng)元的存活[45]．所以，ADOA是由核DNA突變引起的線粒體動力學障礙致使節(jié)細胞死亡視神經(jīng)萎縮的疾?。?009年，White等[46]發(fā)現(xiàn)，在ADOA的小鼠模型中，6月齡的小鼠模型與正常小鼠在視神經(jīng)軸突形態(tài)上并無明顯差異，9月齡的小鼠視神經(jīng)開始出現(xiàn)變性，到24個月時，模型鼠視神經(jīng)數(shù)量比正常小鼠明顯減少，此時節(jié)細胞層的自噬小體的數(shù)量也明顯增多．2010年，Heiduschka等[47]用熒光金逆行標記ADOA模型視網(wǎng)膜節(jié)細胞，發(fā)現(xiàn)20月齡的ADOA小鼠模型視網(wǎng)膜外周和中央節(jié)細胞的數(shù)量都明顯下降．熒光金標記的節(jié)細胞減少反映了ADOA模型視神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運的逆向運輸發(fā)生了障礙．但也有研究推測ADOA并非僅由線粒體一個原因所致，OPA1的另一個作用是與嵴相互聯(lián)系，從而在細胞凋亡中起作用[48]．ADOA的臨床表現(xiàn)與開角青光眼比較相似，在發(fā)病早期甚至會造成誤診．而開角青光眼患者OPA1基因的表達也可以出現(xiàn)異常[49]．有研究發(fā)現(xiàn)，在DBA/2J的慢性青光眼模型視神經(jīng)處，線粒體融合、嵴的體積等都有異常，且在此處OPA1基因的表達也有所下降[50]．神經(jīng)元的存活在一定程度上與由線粒體功能決定的能量供給直接相關(guān)．2012年，Park等[51]發(fā)現(xiàn)在大鼠的青光眼模型中存在自噬小體產(chǎn)生的現(xiàn)象．這些發(fā)現(xiàn)表明，ADOA中節(jié)細胞的死亡機制與青光眼模型有許多相似之處．對ADOA視神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運方面的研究還很少，如果在動物模型上對順向轉(zhuǎn)運和逆向轉(zhuǎn)運進行詳盡的研究，也可能為該疾病的治療提供線索．目前，ADOA還沒有有效的治療手段．在一個果蠅的ADOA模型中發(fā)現(xiàn)增加的活性氧能夠影響果蠅的病理學表型[52]，這使抗氧化治療成為可能的方案．因為ADOA是顯性遺傳，對患者的基因檢測及基因治療，理論上應(yīng)該可以獲得滿意的療效，但目前尚未見到對ADOA基因治療的報道．而青光眼和ADOA相似的癥狀及神經(jīng)節(jié)細胞相似的凋亡機制提示，神經(jīng)保護及軸漿轉(zhuǎn)運的恢復，可能也不失為治療ADOA的策略．在凋亡誘導因子(AIF)基因突變的小鼠中，用AAV攜帶正常的AIF基因進行眼內(nèi)注射，顯示基因治療后能夠減少視神經(jīng)的萎縮[53]．AIF是核基因，其缺陷也影響到視網(wǎng)膜線粒體功能．所以這項研究，為用基因治療修復與線粒體功能相關(guān)的核基因治療視神經(jīng)萎縮，為ADOA可能的干預提供技術(shù)路線．
2．3Leber’s遺傳性神經(jīng)病變(LHON)150年前，第一例LHON由vonGraefe報道，而因TheodorLeber于1871年對其進行深入的臨床分析而得名．這種遺傳的視神經(jīng)病變在任何一個年齡階段都會出現(xiàn)，但多數(shù)發(fā)生在20～40歲之間，且往往雙眼都患病．由于在男性青年中多發(fā)，一度被認為是伴X染色體遺傳．1988年，Wallace和他的同事們[54]發(fā)現(xiàn)了第一個LHON相關(guān)的線粒體基因的突變———ND4基因，一個編碼NADH脫氫酶的基因，此病才被證實是線粒體染色體發(fā)生突變的母系遺傳．隨后，其他的線粒體突變基因也被發(fā)現(xiàn)[55-56]．導致LHON最重要的原因是線粒體基因編碼涉及電子傳遞鏈復合體Ⅰ蛋白的突變．有研究表明，LHON中節(jié)細胞的死亡機制可能是細胞凋亡[57]，而離體研究表明這可能是由于ATP供給不足造成葡萄糖的合成困難而引起的[58]．復合體Ⅰ是活性氧的主要來源，LHON可能由于活性氧的增加導致節(jié)細胞凋亡．另有研究表明，已有突變的線粒體阻隔Ca2+的能力也有所下降，致使線粒體內(nèi)Ca2+的濃度增加[59]．這些改變都可能導致神經(jīng)節(jié)細胞的損傷甚至凋亡．LHON病人也會表現(xiàn)出視敏度下降、色覺障礙，嚴重時，視神經(jīng)成杯狀并萎縮[26]，這可能是因為視神經(jīng)的黃斑束處纖維更薄更容易受到破壞，也可能是由于能量代謝異常引起軸漿轉(zhuǎn)運功能下降而在視神經(jīng)上表現(xiàn)出的相似癥狀．但是，目前似乎并沒有關(guān)于LHON中軸漿轉(zhuǎn)運功能是否或如何受到影響的報道．不過，線粒體功能障礙可能對軸漿轉(zhuǎn)運有重要影響也不是無端的推測．2000年，Sadun等[60]對兩例LHON患者的節(jié)細胞死亡及視神經(jīng)減少的情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)這兩例LHON患者的視神經(jīng)軸突減少量從95%～99%不等，位于中央的較小直徑的軸突損傷最為嚴重，直徑大的軸突相對比較完整．當然由于患者年齡、患病時間等因素的不同，不同LHON病人的視神經(jīng)減少程度也不盡相同．關(guān)于治療LHON的探索一直在持續(xù)，但到目前為止還沒有十分有效的方法．常規(guī)的是化學藥物治療，主要研究有維生素和溴莫尼定．雖然維生素B12不能成功治療LHON，但它在由LHON維生素B12缺乏引起的視力喪失方面還是能夠發(fā)揮一定作用的[61-62]．溴莫尼定是一種腎上腺素α2受體激動劑，能夠通過上調(diào)Bcl-2減少節(jié)細胞的死亡[63-64]，但由于受試者招募數(shù)量和并未達到減輕視覺損傷的目的，該藥在臨床試驗階段即被終止[65]．另外還有一些抗氧化的藥物，如輔酶Q10和艾地苯醌．輔酶Q10是線粒體電子傳遞鏈的一個輔因子．但現(xiàn)在還沒有輔酶Q10治療LHON成功的案例，一個可能的原因是輔酶Q10從磷脂膜往線粒體的傳送存在障礙．艾地苯醌是輔酶Q10的衍生物，克服了上述輔酶Q10的缺點．2009年，Eng等[66]的研究顯示，7名接受艾地苯醌治療的LHON患者的視敏度、色覺及視野都有所恢復．LHON最根本的原因是線粒體基因ND4的突變．從目前的情況看，也許可以通過基因治療根治LHON．2012年Yu等[67]成功地將能夠表達線粒體ND4基因的AAV病毒載體注射至LHON小鼠眼中，發(fā)現(xiàn)在線粒體中ND4DNA的表達升至80%．Bainbridge等[68]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過基因治療的患者視敏度在治療后6～12個月時恢復至最高水平，12個月之后又有所下降，但較未治療眼仍為明顯好轉(zhuǎn)．從上述討論可以看出，基因治療對LHON來講是從最根本致病機理出發(fā)的一種治療方法，也是效果最為顯著的一種方法．因為LHON是一個雙側(cè)眼均病變的視神經(jīng)疾病，且發(fā)病時間有一定的差別，所以在確診后對未發(fā)病眼的干預，推測可以達到令人滿意的療效．不過，基因治療后可能的免疫反應(yīng)會影響其實施，如何用最小劑量的載體病毒表達出最多的ND4蛋白[69]，也是一個亟待解決的問題．
3總結(jié)與展望
