發(fā)布時(shí)間：2024-02-21 14:41:57
序言：寫作是分享個(gè)人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因多態(tài)性研究樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
[關(guān)鍵詞] Toll樣受體；基因多態(tài)性；膿毒癥
[中圖分類號(hào)] R631 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）25-22-03
Study of Toll-like Receptor Gene Polymorphism in Sepsis
WANG Zhiyi SUN Laifang
Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Sepsis is defined as the systemic inflammatory response of the body to an infection. Numerous studies show that the susceptibility and clinical outcome of sepsis associated with the different genetic background. This review summarizes the research on relationship between the sepsis and Toll-like receptor gene polymorphisms.
[Key words] Toll-like receptors；Gene polymorphisms；Sepsis
膿毒癥是感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，是創(chuàng)傷、燒傷、術(shù)后感染和危重病的常見并發(fā)癥，可進(jìn)一步發(fā)展成嚴(yán)重膿毒血癥、膿毒性休克和器官功能障礙綜合征，甚至死亡。流行病學(xué)調(diào)查顯示[1]，膿毒癥的發(fā)病率和死亡率隨年齡的增長(zhǎng)而增加，且黑人膿毒癥易感性比白人高，死亡率也明顯高于其他人種，可見機(jī)體的遺傳因素對(duì)膿毒癥的易感性和臨床轉(zhuǎn)歸具有重要的作用。為進(jìn)一步證實(shí)遺傳因素對(duì)膿毒癥的作用，2001年國(guó)際膿毒癥定義會(huì)議建議將遺傳背景因素作為膿毒癥病因的重要組成部分進(jìn)行研究。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)膿毒癥的基礎(chǔ)與臨床研究十分重視，大量研究表明Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[2]。本文就膿毒癥與TLRs基因多態(tài)性研究作如下綜述。
1Toll樣受體
TLRs是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子。1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)決定果蠅的背腹側(cè)分化的基因，將其命名為Toll基因。目前，在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有11個(gè)，根據(jù)染色體的位置、基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，可分為5個(gè)亞科，即TLR2（包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10）、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9（包括TLR7、TLR8和TLR9）。TLRs結(jié)構(gòu)包括胞外富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRR），跨膜區(qū)，胞內(nèi)Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域。TLRs介導(dǎo)的信號(hào)途徑包括激活NF-κB、MAP激酶、干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factors，IRFs），從而釋放細(xì)胞因子、化學(xué)增活素、干擾素與免疫球蛋白，在宿主防御免疫反應(yīng)方面起著重要作用。1997年，Medzhitov等報(bào)道了與果蠅同源性的人類Toll，當(dāng)其過多表達(dá)時(shí)可活化NF-κB，并誘發(fā)刺激分子表達(dá)[3]。
2TLRs基因多態(tài)性與膿毒癥
基因多態(tài)性是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1％，是人體對(duì)疾病易感性與耐受性、臨床表型多樣性及藥物治療反應(yīng)差異性的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)TLRs、腫瘤壞死因子TNF等炎癥因子、絲裂原活化抑制因子（PAI-1）、人白細(xì)胞抗原（HLA）和熱休克蛋白（HSP-70）等基因多態(tài)性均與膿毒癥有關(guān)。目前，研究較多的是TLRs基因多態(tài)性。
2.1 TLR4基因多態(tài)性與膿毒癥
Poltorak等[4]和Qureshi等[5]用遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，攜帶C3H/HeJ和C57BL/lOScCr基因的兩株小鼠表現(xiàn)為對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）高度耐受性和對(duì)革蘭陰性菌感染高度易感性。前者為TLR4基因第3外顯子的錯(cuò)義突變致TLR4基因編碼產(chǎn)物多肽鏈第712位上的脯氨酸被組氨酸所取代，后者為TLR4基因存在無義突變。這種基因突變或多態(tài)性解釋了同種個(gè)體間對(duì)膿毒癥易感性的差異和不同種屬對(duì)部分脂多糖結(jié)構(gòu)反應(yīng)不同，表明TLR4基因是調(diào)節(jié)LPS反應(yīng)的關(guān)鍵。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）研究是最常見的基因組學(xué)研究方法。目前對(duì)TLR4的SNP研究主要集中在Asp299Gly（299位天門冬氨酸與甘氨酸的置換）和Try399Ile（399位蘇氨酸與異亮氨酸的置換）2個(gè)位點(diǎn)的突變。Arbour等[6]通過轉(zhuǎn)染Th.1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Asp299Gly位點(diǎn)的突變可干擾TLR4介導(dǎo)的LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低呼吸道上皮細(xì)胞對(duì)人LPS的刺激反應(yīng)性。Agnese等[7]研究表明Asp299Gly/Thr399Ile突變可是使革蘭氏陰性菌感染發(fā)生率明顯升高。Lorenz等[8]發(fā)現(xiàn)單純Asp299Gly多態(tài)性只存在于感染性休克患者中，且有等位基因TLR4 Asp299Gly/Thr399Ile的患者易發(fā)生革蘭陰性菌感染。Barber RC等[9]研究發(fā)現(xiàn)，燒傷患者TLR4的Asp299Gly突變可增加其發(fā)生嚴(yán)重膿毒癥的危險(xiǎn)性。Shalhub等[10]認(rèn)為TLR4基因的突變與創(chuàng)傷后膿毒癥的嚴(yán)重性相關(guān)，并認(rèn)為這種相關(guān)性可能不僅是由Asp299Gly單核甘酸多態(tài)性引起的，也可能與TLR4其他位點(diǎn)的突變協(xié)同導(dǎo)致。
以上研究表明TLR4基因多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，但也有不少研究得出陰性結(jié)果。Jessen等[11]研究顯示，TLR4的基因多態(tài)性與革蘭氏陰性菌引起的膿毒癥無明顯相關(guān)性。Feterowski等[12]對(duì)多種微生物感染引起的術(shù)后膿毒癥進(jìn)行研究，結(jié)果顯示膿毒癥的發(fā)生率及死亡率與TLR4位點(diǎn)的突變無相關(guān)性。Kumpf[13]，Taudoff[14]等認(rèn)為Asp299Gly與Thr399Ile的突變與膿毒癥細(xì)胞因子的變化無明顯相關(guān)性。國(guó)內(nèi)學(xué)者也有類似報(bào)道[15]，單小鷗等[16]研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因（Asp299Giy、Thr399Ile）多態(tài)性與溫州地區(qū)漢族兒童膿毒癥易感性無明顯相關(guān)性。因此，TLR4基因多態(tài)性與膿毒癥相關(guān)性及參與因素的影響仍有待進(jìn)一步研究。
2.2TLR2基因多態(tài)性與膿毒癥
TLR2是TLRs家族中的主要成員之一，是宿主防御細(xì)菌、真菌及病毒感染的識(shí)別受體。目前已發(fā)現(xiàn)TLT-2基因存在兩種多態(tài)性：Arg753Gln（TLR-2-Ⅰ）和Arg677Trp（TLR-2-Ⅱ）。前者與膿毒癥的發(fā)生有關(guān)，后者與瘤型麻風(fēng)的發(fā)生有關(guān)[17]。研究表明，TLR2基因敲除小鼠對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的易感性明顯增強(qiáng)，對(duì)螺旋體的易感性也較野生型的高[18]。Lorenz等[19]對(duì)91例膿毒癥休克患者進(jìn)行TLR2基因分析，發(fā)現(xiàn)2例患者具有Arg753Gln多態(tài)性，且都伴有金黃色葡萄球菌感染。Thuong等[20]對(duì)358名越南結(jié)核患者研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因多態(tài)性與肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎的易感性有關(guān)。以上研究表明，TLR2基因的變異可能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)致死性細(xì)菌的易感性。而Moore CE等[21]對(duì)420例金黃色葡萄球菌感染患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示TLR2的Ar9753Gln基因多態(tài)性與機(jī)體對(duì)金黃色葡萄球菌的易感性和嚴(yán)重程度不相關(guān)。宋振舉等[22]研究也顯示，TLR2基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群的重癥社區(qū)獲得性肺炎易感性和預(yù)后無明顯相關(guān)性。因此，TLR2基因多態(tài)性與膿毒癥的確切關(guān)系尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。
2.3TLR5基因多態(tài)性與膿毒癥
TLR5在細(xì)菌鞭毛誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中起核心作用。Lissauer等[23]研究表明，膿毒癥患者TLR5的表達(dá)較正常人群顯著增高。TLR5基因內(nèi)存在3個(gè)頻率較高的編碼性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。其中兩個(gè)錯(cuò)義多態(tài)性位點(diǎn)592N（rs2072493）和L616F（rs5744174）位于TLR5的胞外區(qū)，為引起氨基酸發(fā)生改變的SNP位點(diǎn)。另一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)R392X（rs5744168）是無義突變，可引起11LR5的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)部分的完全缺失，該位點(diǎn)與發(fā)生軍團(tuán)菌引起的肺炎的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[24]。以上研究表明LR5很可能是膿毒血癥的易感基因，其遺傳學(xué)變異可能會(huì)影響TLR5的功能。而王志富等[25]對(duì)中國(guó)255例膿毒癥患者和260例對(duì)照個(gè)體的3個(gè)cSNP（rs5744168，ra5744174和rs2072493）進(jìn)行研究，結(jié)果顯示以上3個(gè)導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變的SNP位點(diǎn)與膿毒血癥的易感性和嚴(yán)重程度無顯著關(guān)聯(lián)，但不排除其它未進(jìn)行研究的TLR5基因多態(tài)性可能會(huì)影響膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。
2.4Toll樣受體基因多態(tài)性的種族差異對(duì)膿毒癥的影響
在TLRs基因多態(tài)性與炎性應(yīng)答損傷的遺傳易感性研究中，不同種族及地區(qū)的研究結(jié)果往往不同。通過對(duì)比中國(guó)漢族與其他種族TLR4基因的Asp299GIy、Thr399Ile和TLR2基因的Ar9753Glu、Ar9677Trp多態(tài)性分布，發(fā)現(xiàn)不同種族及地區(qū)人群的等位基因頻率及基因型頻率的分布有差異。呂欣等[26]檢測(cè)了健康漢族人群及缺血性卒中患者DNA樣本，未發(fā)現(xiàn)Asp299Gly和Thr399Ile基因多態(tài)性。Hang等[27]也認(rèn)為TLR4基因編碼區(qū)Asp299Gly和Thr399Ile基因多態(tài)性在中國(guó)人群中非常罕見。其他類似研究也表明中國(guó)浙江漢族人[28]、中國(guó)湖北漢族人[29]與日本人的等位基因頻率及基因型頻率相似，均未檢測(cè)到TLR4基因Asp299Gly、TLR2基因Ar9753Glu和Ar9677Trp的突變位點(diǎn)，而德國(guó)人TLR4基因的Asp299Gly突變頻率5.6％、Ar9753Glu突變頻率9.4％，西班牙人Ar9753Glu突變頻率1％[30]，突尼斯人Ar9677Trp為31％[31]。lorenz等[8]、Agnese DM等[32]、Read等[33]分別調(diào)查了73例美國(guó)人、39例美國(guó)人、879例英國(guó)人和80例蘇格蘭人（均為健康白種人），發(fā)現(xiàn)Asp299Gly攜帶者的比例分別為13％，11％，10.5％，10％。據(jù)Smirnoval等[34]統(tǒng)計(jì)，歐洲人種多為Asp299Gly/Thr399Ile單倍型，Asp299Gly單倍型在非洲人中出現(xiàn)頻率更高，在亞洲人中這2種突變均極為罕見，也證實(shí)了大部分研究中出現(xiàn)這2處基因突變的人群都為白種人或非洲人。
3結(jié)語
盡管有大量研究表明Toll樣受體基因多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。通過不同遺傳背景人群的研究，可以初步推測(cè)我國(guó)漢族人群中TLR4基因多態(tài)性Asp299Gly攜帶者的比例較西方白種人低。TLRs基因多態(tài)性的種族差異研究使我們認(rèn)識(shí)到遺傳背景的不同可能會(huì)影響其基因多態(tài)性在感染性疾病發(fā)病中的作用。為膿毒血癥臨床診療提供新的思路、方法和途徑。
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【關(guān)鍵詞】腫瘤壞死因子;相關(guān)凋亡配體（FAS-670）; 基因多態(tài)性;胃癌
【中圖分類號(hào)】R735.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1008-6455（2011）04-0134-02
細(xì)胞凋亡是一種基本的生物現(xiàn)象，并參與了各種生理功能，如在機(jī)體發(fā)育過程中或在某些病理過程，包括免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤的發(fā)展，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和消除的有害或有潛在危險(xiǎn)的細(xì)胞。FasL 系統(tǒng)在許多類型的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過程中扮演了重要角色。 Fas抗原是一個(gè)45 kDa的細(xì)胞表面蛋白，屬于死亡受體家族的腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族。結(jié)合的Fas配體（ FasL ）的Fas抗原啟動(dòng)死亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 Fas受體廣泛表達(dá)在各種組織細(xì)胞上，但FasL表達(dá)僅限于細(xì)胞內(nèi)的免疫系統(tǒng)，如激活T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，或免疫特異細(xì)胞，如眼睛和繁殖器官[1]。許多腫瘤細(xì)胞都已經(jīng)被證明有Fas和FasL表達(dá)的改變。迄今為止，一些研究表明在許多人類惡性實(shí)體腫瘤，包括食管癌[2]和乳腺癌中，F(xiàn)as出現(xiàn)下調(diào)。班尼特等人曾[3]報(bào)道了胃癌中存在FasL上調(diào)和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）凋亡。其他的一些研究也表明在人胃癌細(xì)胞腺瘤和癌能檢測(cè)到許多凋亡細(xì)胞，及出現(xiàn)胃癌組織FasL上調(diào)，從而逃避宿主免疫攻擊[4]。Fas基因已被確定位于染色體10q24.1區(qū)域，而FasL基因位于染色體1q23，兩個(gè)潛在功能多態(tài)性（即白細(xì)胞介素-1B-511T和IL-1RN第2/2）被認(rèn)為與幽門螺旋桿菌感染與IL-1β的表達(dá)有關(guān)，由此可能增加了發(fā)生各腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。但研究胃癌患者和其Fas FasL基因多態(tài)性的之間關(guān)系還未見報(bào)道。
1 材料與方法
1.1 研究對(duì)象
（1）胃癌組 171例胃癌患者來自2001年12月～2005年12月武漢大學(xué)中南醫(yī)院門診和住院患者，所有病例均經(jīng)我院組織病理學(xué)證實(shí)為胃腺癌，采樣前未進(jìn)行過化療或放療。其中男72例，女63例；平均年齡61.00±1. 64歲（24～84歲）。
（2）正常對(duì)照組 收集同期武漢大學(xué)中南醫(yī)院健康體檢者152例，其中男92例，女60例；平均年齡50.03±1.47歲（21～77歲），均為無血緣關(guān)系的湖北漢族人，既往無消化道癥狀、無糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎及炎癥性腸病等病史。
1.2 方法
（1）DNA提?。喝?ml抗凝血，用蛋白酶K（Merck公司）消化，酚/氯仿法提取基因組DNA。
（2）Fas-670基因PCR擴(kuò)增：Fas-670基因片段PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由北京三博遠(yuǎn)志生物工程技術(shù)有限公司合成，順式5’-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3’；反式5’-GGCTGTCCATGTTGTGGCTGC-3’。PCR反應(yīng)體系總體積25l，含滅菌雙蒸水18.51，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5l，每側(cè)引物各10pmol， dNTPs（Clontech公司）10mmol/L 0.5l，TaqDNA聚合酶（Biostar公司）2U，DNA模板11（約40～100ng）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4分鐘，接著30個(gè)循環(huán)，94℃變性30秒，56℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒，72℃終末循環(huán)5分鐘，最后置于4℃終止反應(yīng)。
（3）限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：取10l PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶Mva I（MBI公司）0.5l（10U/l）于37℃消化酶切過夜，于65°C滅活20分鐘。
（4）PCR產(chǎn)物鑒定：對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物片段采用2%瓊脂糖凝膠電泳電泳（100V，1.5小時(shí)）分離，溴化乙錠染色分析基因型。
233+99G
A（233+99bp）
G（189+99+44bp）
4 結(jié)果
4.1 Fas-670點(diǎn)多態(tài)性酶切結(jié)果:Fas-670基因626位點(diǎn)電泳酶切結(jié)果見圖1?；蛐虲/C純合子酶切片段為189、99、44bp三條帶, G/G純合子為233和99bp二條帶, C/G雜合子酶切片段為189、99、44bp和233bp四條帶。
4.2 Fas-670基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn):經(jīng)χ2檢驗(yàn), 胃癌組和正常對(duì)照組人群Fas-670基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。（胃癌組χ25.630, P>0.05; 正常對(duì)照組χ23.449,P>0.05）。
4.3 胃癌患者Fas-670位點(diǎn)基因多態(tài)性分析:如表1所示，與正常對(duì)照組比較，胃癌患者組FAS-670位點(diǎn)C/G+G/G基因型頻率略低（62.9% vs 67.5%；Fisher exactp0.4667; OR1.219; 95% CI0.7582-1.662）；并且，慢性胃炎組的FAS-670位點(diǎn)C/G+G/G基因型頻率與正常對(duì)照組比較也略低（66.2% vs 67.5%；Fisher exactp0.8809;odds ratio1.058; 95% CI0.5880-1.905）；胃十二指腸潰瘍組的FAS-670位點(diǎn)C/G+G/G基因型頻率與正常對(duì)照組比較也略高（69.6% vs 67.5%；Fisher exactp0.8783; odds ratio1.058; 95% CI0.588-1.905）。
表1示，在FAS-670位點(diǎn)，胃癌組C、G等位基因頻率與正常對(duì)照組無明顯差異（p0.4262;odds ratio1.115; 95% CI0.8369-1.595）。
表1 胃癌、慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍及正常對(duì)照組FAS-670-626基因多態(tài)性分布
5 討論
M acFarlane等報(bào)道,FAS-670基因（death receptor 4 gene , FAS-670）626等位基因與胃癌發(fā)生危險(xiǎn)性無關(guān),日本Frank B[1]的研究并也支持上述結(jié)果。本研究選擇武漢地區(qū)正常人作為對(duì)照, 對(duì)武漢地區(qū)FAS-670基因多態(tài)性和胃癌的關(guān)系進(jìn)行研究。本研究結(jié)果支持Frank B 和Mac Farlane等的研究結(jié)果,這說明攜帶FAS-670的626等位基因與增加武漢地區(qū)胃癌發(fā)病的危險(xiǎn)性無關(guān)。我們對(duì)FAS-670基因多態(tài)性的研究結(jié)果與國(guó)外的研究比較發(fā)現(xiàn), 武漢地區(qū)人群FAS-670的 等位基因頻率與歐洲等國(guó)家相似。雖然本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組和正常組之間宿主基因因素FAS-670的等位基因的分布不存在差異,但這并不能排除這些等位基因可能增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的可能。
在本次研究中沒有發(fā)現(xiàn)武漢正常人群中FAS-670位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌之間有相關(guān)性，我們分析原因有如下可能樣本選取的偏倚，我們選取的為武漢市漢族人，為一個(gè)地區(qū)的一個(gè)民族，所以可能出現(xiàn)了假陰性結(jié)果，所以我們可以在以后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量包括不同民族進(jìn)行研究；也可能是由于胃癌的發(fā)生在不同國(guó)家、地區(qū)、種族間都存在著明顯差異，胃癌的發(fā)生機(jī)制可能不同?？傊?，胃癌是一類異質(zhì)性很高、變化復(fù)雜的惡性綜合征，但是胃癌細(xì)胞的主要特征是基因組不穩(wěn)定性，基因組不穩(wěn)定性可發(fā)生在不同水平,從單核甘酸、微衛(wèi)星、基因、染色體結(jié)構(gòu)性成分直至整條染色體。我們目前的研究發(fā)現(xiàn)FAS-670G/C基因型與武漢地區(qū)胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，為了確定胃癌的易感基因我們還需要在不同對(duì)象中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
參考文獻(xiàn)
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目的 探討老年缺血性腦卒中與內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶（eNOS）基因變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）多態(tài)性的關(guān)系。方法 選擇老年缺血性腦卒中患者112例作為病例組，同期選擇年齡與性別相匹配的健康志愿者或其他住院患者105例作為對(duì)照，通過PCR技術(shù)和聚丙烯酰胺電泳來確定其基因型。結(jié)果 病例組eNOS基因ab基因型的頻率明顯高于對(duì)照組(22.3% vs 12.4%，P＜0.05)，a等位基因的頻率也高于對(duì)照組（12.9% vs 7.0% ，P＜0.05）。結(jié)論 ab基因型與老年缺血性腦卒中有相關(guān)性，a等位基因可能是中國(guó)老年缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
【關(guān)鍵詞】 一氧化氮合酶；基因多態(tài)性；VNTR；老年；缺血性腦卒中
血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（NOS）編碼基因存在多種基因多態(tài)性。其中，第4號(hào)內(nèi)含子27個(gè)堿基的變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）多態(tài)性與血漿一氧化氮（NO）水平密切相關(guān)，該多態(tài)性與心腦血管病的相關(guān)性研究較多，但結(jié)論并不一致。Matyar等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞型NOS(eNOS)4a/b基因多態(tài)性是南部土耳其人冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而Vasilakou等〔2〕發(fā)現(xiàn)在希臘人中該基因多態(tài)性與早發(fā)的冠心病沒有相關(guān)性。本研究的目的是探討eNOS基因VNTR多態(tài)性與中國(guó)老年缺血性腦卒中的關(guān)系。
1 對(duì)象與方法
1.1 研究對(duì)象
1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)
選擇2002年7～12月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的112例老年缺血性腦卒中患者作為病例組，其中36例短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)，76例腦梗死，均行頭顱MRI和/或CT掃描明確診斷，符合1996年第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除腦出血和占位性病變。選取同期住院的其他疾病患者和健康志愿者105例作為對(duì)照。對(duì)照組均無腦卒中或冠心病病史。病例組平均年齡(64.9±11.2)歲，男62例；對(duì)照組平均年齡(63.9±11.9)歲，男53例，兩組的年齡與性別相匹配，入選對(duì)象均行血糖、血脂等檢查。
1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)
高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)為血壓≥140/90 mmHg或正服用降壓藥物；糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥7.0 mmol/L或服用降血糖藥物；吸煙的標(biāo)準(zhǔn)為正在吸煙>5支/d或有吸煙史，血脂異常的標(biāo)準(zhǔn)為總膽固醇(TC)≥5.62 mmol/L和/(或)甘油三酯(TG)≥1.92 mmol/L或服用降血脂藥物。
1.2 方法
1.2.1 提取基因組DNA
入選者均于清晨空腹抽取靜脈血1 ml，加20 μl EDTA（濃度150 ng/ml）抗凝，4℃冰箱短期存放。采用UltraPureTM基因組DNA提純?cè)噭┖校ū本┵惏偈⒐旧a(chǎn)），提取的基因組DNA置于-20℃保存。
1.2.2 目的基因片段PCR擴(kuò)增方法
引物參照Uwabo等〔3〕的設(shè)計(jì)。正義寡核苷酸序列為5′GGGAACCTCAGCCCAGTAGTGAA3′，反義寡核苷酸序列為5′GTGGTCACAGGCGTTCCAGTAAC3′。反應(yīng)總體系50 μl，其中10×Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，引物各5 μl，模板DNA 2 μl（約150 ng），Taq酶1.5 U（0.3 μl），甲酰胺1μl，用雙蒸水補(bǔ)齊至50 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 3 min后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為：變性94℃ 45 s，退火56.5℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸12 min終止反應(yīng)。取3 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6％非變性聚丙烯酰胺凝膠上做垂直電泳，電壓60 V，時(shí)間3 h，以pGEM7Zf(+)HaeⅢ Marker（華美公司生產(chǎn)）為參照，在0.5 μg/ml溴化乙錠染液中染色40 min后在紫外線燈下觀察結(jié)果并照相。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較用非配對(duì)的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Logistic回歸分析計(jì)算比數(shù)比并進(jìn)行危險(xiǎn)因素獨(dú)立性分析。
2 結(jié) 果
2.1 病例組與對(duì)照組各種危險(xiǎn)因素比較
吸煙、高血壓、糖尿病等在病例組的比例均較對(duì)照組高（P0.05），見表1。表1 兩組各危險(xiǎn)因素的比較〔n(略)〕
2.2 eNOS基因VNTR多態(tài)性電泳結(jié)果
eNOS基因VNTR多態(tài)性主要有2種等位基因，27 bp的序列重復(fù)4次為a，重復(fù)5次為b，在電泳圖中分別為417 bp和444 bp的片段，從而構(gòu)成3種基因型(aa，ab，bb)，見圖1。
2.3 兩組eNOS基因型和等位基因頻率的比較
病例組與對(duì)照組的ab基因型頻率分別為22.3%和12.4%，兩者比較有顯著差異(P
2.4 病例組各種危險(xiǎn)因素的獨(dú)立性分析
病例組各危險(xiǎn)因素及eNOS VNTR多態(tài)性的比數(shù)比（OR）分析及95％可信區(qū)間（95% CI），見表3。通過對(duì)各種危險(xiǎn)因素的多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病、吸煙及ab基因型與老年缺血性腦卒中均明顯相關(guān)，是老年缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。表3 病例組各危險(xiǎn)因素以及ab基因型的OR值及95％CI（略）
3 討論
NOS是NO合成的關(guān)鍵酶，可催化精氨酸代謝為NO和瓜氨酸。根據(jù)細(xì)胞和組織來源分為3種：神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮細(xì)胞型(eNOS)和免疫型NOS(iNOS)。eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，可以被多種介質(zhì)激活，包括乙酰膽堿、P物質(zhì)、組氨、精氨酸、血管加壓素、緩激肽、前列腺素F和內(nèi)皮素R等。eNOS的激活導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中NO的產(chǎn)生增加，并引起一系列的生物學(xué)效應(yīng)，如舒張平滑肌細(xì)胞，抑制血小板聚集和黏附于血管內(nèi)皮，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生，阻礙低密度脂蛋白的過氧化而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用等。NO還可通過抑制內(nèi)皮素和血管緊張素的產(chǎn)生從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生。
人類eNOS的編碼基因位于第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂（7q36），含有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，總長(zhǎng)21 kb，編碼產(chǎn)物為含有1 203個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該基因存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中研究最多的是4號(hào)內(nèi)含子的VNTR多態(tài)性、7號(hào)外顯子G849T多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)T786C多態(tài)性。VNTR多態(tài)性主要有2種等位基因，27 bp的序列重復(fù)4次為a，重復(fù)5次為b，從而構(gòu)成3種基因型(aa，ab，bb)。eNOS基因多態(tài)性可影響eNOS的功能，導(dǎo)致血管系統(tǒng)中NO濃度改變，并由此影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，因此可能與冠心病和缺血性腦血管疾病有關(guān)。
eNOS基因不同位置的變異與心腦血管疾病的相關(guān)性不同。1996年Wang等〔4〕發(fā)現(xiàn)，澳大利亞長(zhǎng)期吸煙者的eNOS第4號(hào)內(nèi)含子基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系密切，吸煙和eNOS4a/a分別在環(huán)境和遺傳方面是導(dǎo)致冠心病的主要因素。Lee等〔5〕對(duì)韓國(guó)男性冠狀動(dòng)脈疾病病人暷研究也發(fā)現(xiàn)eNOS基因a/b多態(tài)性與小于51歲的男性患者的冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)展有相關(guān)性。Salim等〔6〕發(fā)現(xiàn)冠心病患者的等位基因a的頻率明顯高于對(duì)照組。Hou等〔7〕對(duì)中國(guó)人的研究，證實(shí)了eNOS第4號(hào)內(nèi)含子基因多態(tài)性可能是中國(guó)人缺血性腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在無常見危險(xiǎn)因素的缺血性腦血管病患者中尤為顯著。
eNOS基因多態(tài)性與冠心病、心肌梗死的關(guān)系得到了多國(guó)學(xué)者的肯定，但也存在分歧。德國(guó)學(xué)者Sigusch等〔8〕栐1 043例歐洲人的研究表明，冠心病及其嚴(yán)重程度與eNOS4a/b多態(tài)性無相關(guān)性。Yahashi等〔9〕對(duì)日本人該基因多態(tài)性與缺血性卒中的關(guān)系進(jìn)行了研究，127例患者（其中18例為血栓栓塞，58例為腔隙性腦梗死，51例為無癥狀性腔隙性腦梗死）與91例對(duì)照的b等位基因頻率之比為0.862/0.868，缺血性卒中亞組中等位基因的頻率之比為0.889/0.862/0.853，其差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MacLeod等〔10〕在361例缺血性卒中患者與236例對(duì)照中，對(duì)eNOS基因7號(hào)外顯子的G894T多態(tài)性進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)NN基因型在兩組中的分布無差異，提示該多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死和TIA無關(guān)。
本研究發(fā)現(xiàn)老年缺血性腦卒中組ab基因型的頻率較對(duì)照組明顯增高（22.3% vs 12.4%），a等位基因的頻率在病例組也明顯偏高（12.9% vs 7.0%）。用多元Logistic回歸分析校正了年齡、高血壓、糖尿病和吸煙等危險(xiǎn)因素的影響后，ab基因型較bb基因型的OR為1.98（95% CI=0.87～3.56，P< 0.05），與Hou等〔7〕報(bào)道的結(jié)果一致，更進(jìn)一步證實(shí)了在中國(guó)人群中eNOS基因VNTR多態(tài)性與缺血性腦卒中有相關(guān)性，ab基因型可能是影響中國(guó)老年人發(fā)生缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
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關(guān)鍵詞：ADH2；ALDH2；基因多態(tài)性；飲酒；胃癌
中國(guó)分類號(hào)：R183.3*2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B
胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，而有關(guān)飲酒與胃癌的關(guān)系研究頗多，研究結(jié)論各異。部分研究認(rèn)為飲酒不是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素或危險(xiǎn)因素很弱，而乙醇脫氫酶2(ADH2)、乙醛脫氫酶(ALDI-L2)基因多態(tài)性與胃癌易感性也存分歧。ADH2和ALDH2是酒精代謝的兩種酶，前者將乙醇氧化成乙醛，而后者將乙醛氧化成醋酸。ADH2和ALDH2的編碼基因有高度的多態(tài)性，ADH2可分為G／G(變異型純合子)、G／A(雜合子基因型)和A／A(野生型純合子)3種基因型，ALDH2也可分為G／G(野生型純合子)、G／A(雜合子基因型)和A／A(變異型純合子)3種基因型。為探索ADH2、ALDH2基因多態(tài)性及飲酒與胃癌的聯(lián)系，為此類研究提供有關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)合有關(guān)專題開展本研究。
1 資料與方法
1.1 資料來源
病例來自常熟市2005年8月-2006年8月期間經(jīng)市二級(jí)醫(yī)院確診，具有本地區(qū)常住戶口男性原發(fā)胃癌新發(fā)病例，病例均經(jīng)手術(shù)或病理確認(rèn)。常熟市疾病預(yù)防控制中心登記201例，其中161例新發(fā)病例是通過原發(fā)灶病理診斷。對(duì)照組采用隨機(jī)抽樣的原則，抽取同性別、上下年齡不超過2歲、與病例居住在同村、或同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)有常熟市常住戶口的非腫瘤居民，病例組平均年齡為64.65歲，對(duì)照組199例，平均年齡為64.61歲。
1.2 方法
采用統(tǒng)一的調(diào)查表由經(jīng)專門培訓(xùn)的調(diào)查員通過訪談的方式調(diào)查每位研究對(duì)象，并由質(zhì)控人員對(duì)每張調(diào)查表進(jìn)行審查和驗(yàn)收，對(duì)可疑項(xiàng)目重新調(diào)查。調(diào)查項(xiàng)目包括調(diào)查對(duì)象的一般情況、飲酒情況等內(nèi)容。對(duì)全部研究對(duì)象抽靜脈血，置乙二胺四乙酸鈉抗凝管，分離白細(xì)胞層。用Q IAamp DNA提取試劑盒提取白細(xì)胞DNA，DNA置－30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩ｏ嬀贫x為：相當(dāng)于每周飲高度白酒至少1次，連續(xù)半年以上。酒精消耗總量，按照含酒精飲料中純酒精量計(jì)算，以“千克?年”為單位(平均每天飲純酒精的千克數(shù)×飲酒年數(shù))。含酒精飲料的酒精濃度參照《中國(guó)食物成分表2004》計(jì)算。
1.3 基因型分析
采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和變性高效液相色譜法(DHPLC)檢測(cè)ADH2 Arg47His和ALDH2 Glu487Lys基因型。ADH2Arg47His擴(kuò)增所用引物為F：5‘-GGG CTrTAG ACTGAA’FAA CCTTGG-3‘和R：5‘-AGG GAAAGA GGA AAC TCC TGA A-3‘。ALDH2 Glu487Lys擴(kuò)增所用引物為F：5’TGCTATGATGTGTITGGAGCC和R：5’－GGC TCC GAG CCA CCA-3‘。雜合子基因型可從DHPLC圖形直接確定，野生型純合子和變異型純合子的DHPLC圖形相同，需與已知純合型混合，經(jīng)過變性和復(fù)性過程，再次上樣DHPLC儀分析確定。檢測(cè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物購(gòu)自寶生生物工程有限公司，PCR產(chǎn)物上樣鑒定儀器為WAVE-3500(Transgenomic，USA)。
1.4統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析
數(shù)據(jù)錄入用Epidata 3.0軟件，用SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比值比(OR)及95％可信限(95％)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。
2 結(jié)果
2.1 兩組均衡性檢驗(yàn)
對(duì)病例組和對(duì)照組文化程度以及職業(yè)等一般情況進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，結(jié)果見表1，兩組相關(guān)因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
2.2 ADH2和ALDI-12基因不同分型與胃癌的關(guān)系
分別以ADH2基因野生型(A／A)和ALDH2野生型(G／G)，ADH2基因非野生型和ALDH2基因非野生型的組合與之比較分析，結(jié)果見表2。無論是ADH2基因型還是ALDH2基因型，雜合子基因型和變異型純合子并未增加胃癌的危險(xiǎn)性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.3 ADH2和ALDI-12基因不同分型組合與胃癌的關(guān)系
以病例和對(duì)照ADH2基因野生型(A／A)和ALDH2基因野生型(G／G)為參照，ADH2基因非野生型和AL-DH2基因非野生型的組合與之比較分析，結(jié)果見表3。ADH2基因雜合子基因型、變異型純合子和ALDH2基因雜合子基因型、變異型純合子的不同組合，并不增加胃癌的危險(xiǎn)性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.4 飲酒與胃癌的相關(guān)性
對(duì)是否飲酒以和胃癌的相關(guān)性進(jìn)行分析研究，結(jié)果見表4，進(jìn)行趨勢(shì)性檢驗(yàn)，結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，未發(fā)現(xiàn)胃癌與飲酒有相關(guān)性。
2.5 ADH2、ALDH2基因不同基因組合及飲酒與胃癌的關(guān)系
根據(jù)代謝活性高低以飲酒者的ADH2基因和ALDH2基因型的任意組合和不飲酒者代謝酶活性高的ADH2野生型(A／A)和ALDH2野生型(G／G)組合進(jìn)行比較，比較時(shí)以酒精消耗量1.5千克?年進(jìn)行分層，其結(jié)果見表5。任何其它組合即使酒精消耗量高于1.5千克?年，都未能增加胃癌的危險(xiǎn)性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3 討論
胃癌的危險(xiǎn)因素比較復(fù)雜，而有關(guān)飲酒和胃癌之間的爭(zhēng)議一直很大。張栓虎有關(guān)飲酒與胃癌發(fā)病關(guān)系的Meta分析中，27個(gè)研究中有4個(gè)OR值無顯著性意義。鮑萍萍等研究發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)男性居民飲酒和胃癌的病例對(duì)照研究中，沒有發(fā)現(xiàn)飲酒和胃癌有相關(guān)性，而女性重度飲酒者與胃癌有關(guān)。認(rèn)為是不同性別對(duì)酒精的反應(yīng)不同。
【關(guān)鍵詞】 食管鱗狀細(xì)胞癌；類胰島素生長(zhǎng)因子1；微衛(wèi)星多態(tài)性
Abstract Objective: To investigate the relationship between a microsatellite polymorphism (CA repeats) in the insulin-like growth factor I gene and the risk of esophageal squamous cell carcinoma. Methods: IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism was genotyped among 78 cases with esophageal squamous cell carcinoma and 470 normal controls by fluorescent labeled fragment analysis. And data were analyzed using unconditional logistic regression to evaluate the association of examined polymorphism with esophageal squamous cell carcinoma. Results: No association was found between IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism and esophageal squamous cell carcinoma. Conclusion: IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism (CA repeats) does not play a major role in the development of esophageal squamous cell carcinoma.
Key words Esophageal squamous cell carcinoma; Insulin-like growth factor I (IGF-Ⅰ); Microsatillite polymorphism
類胰島素生長(zhǎng)因子1（IGF-Ⅰ）是一種多功能肽，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和抑制細(xì)胞的凋亡[1]。有研究顯示IGF-Ⅰ在癌癥的發(fā)生過程中起到了重要作用[1]，而其基因的啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)高度多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，即CA重復(fù)與血循環(huán)中的IGF-Ⅰ水平相關(guān)聯(lián)[2]。有一些研究已經(jīng)檢測(cè)了這一多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌的關(guān)系，但結(jié)果不太一致[3-6]。到目前為止未見有這一多態(tài)性與食管癌關(guān)系的報(bào)道，因此在本研究中，我們檢測(cè)了兩者之間是否關(guān)聯(lián)。
1 材料與方法
1.1 樣本 我們收集了78例食管鱗狀細(xì)胞癌患者為觀察組，470例為正常對(duì)照組。觀察組所有病例均經(jīng)病理學(xué)確診，年齡范圍48～79歲，平均年齡64歲，其中男性57例，女性21例。正常對(duì)照組年齡范圍48～80歲，平均年齡62歲，其中男性388例，女性82例。
1.2 基因分型 我們用酚/氯仿抽提法提取DNA，然后采用熒光標(biāo)記片段分析法進(jìn)行基因分型。15μL PCR反應(yīng)體系中含有25ng基因組DNA，200μM dNTPs，0.3μM引物（F:5'-FAM-GCTAGCCAGCTGGTGTTATT-3';R:5'-ACCACTCTGGGAGAAGGGTA-3'），2.5mM MgCl2，0.6U DNA聚合酶。PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性12分鐘，然后10圈循環(huán)，每一循環(huán)中94℃預(yù)變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；然后再20圈循環(huán)，每一循環(huán)中89℃預(yù)變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；最后72℃再延伸5分鐘。擴(kuò)增后，1μL PCR產(chǎn)物和9μL Hi-DiTM甲酰胺以及0.5μL GeneScanTM-500LIZTM標(biāo)準(zhǔn)大小片段混合，在ABI 3730分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并用GeneMapper 4.0生物軟件分析樣品基因型。
1.3 統(tǒng)計(jì)分析 我們用Monte-Carlo法檢測(cè)基因型分布在正常對(duì)照中是否符合Hardy-Weinberg平衡；非條件性Logistic回歸分析來估計(jì)相對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并以優(yōu)勢(shì)比（ORs）和95%可信區(qū)間（95% CIs）表示。所有的OR值都平衡了性別、年齡、吸煙和飲酒等因素的影響。在本研究中，IGF-Ⅰ基因型分為3組：（1）最常見等位基因192bp純合子；（2）192bp雜合子；（3）其它。
2 結(jié)果
在本研究中，IGF-Ⅰ基因微衛(wèi)星多態(tài)性CA重復(fù)顯示有9個(gè)等位基因，長(zhǎng)度從184bp到200bp，最常見等位基因?yàn)?92bp，等位基因分布在觀察組和對(duì)照組中差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。在正常對(duì)照組中，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，這一多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病沒有關(guān)聯(lián)，見表2。表1 IGF-Ⅰ (CA)n等位基因在樣本中的分布表2 IGF-Ⅰ (CA)n 基因型與食管鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)
3 討論
食管癌是一種高度致死性癌癥，其5年生存率僅為10%，目前改善其低生存率只能通過早期腫瘤篩查獲得 [7]，因此識(shí)別一些高度易感人群對(duì)疾病的防治是非常重要的。
大量證據(jù)顯示IGF-Ⅰ系統(tǒng)在食管癌的發(fā)病過程中作用顯著。一些研究提示在人類食管癌中IGF-Ⅰ可通過自分泌作用刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8-9]；而一些群組研究（cohort study）也顯示血清中IGF-Ⅰ水平升高與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈顯著關(guān)聯(lián)[10-11]。由于血循環(huán)中IGF-Ⅰ的濃度并不總是能直接反映局部組織中的產(chǎn)生量，因此識(shí)別一些基因多態(tài)性可能會(huì)幫助我們鑒別IGF-Ⅰ在局部和全身中的長(zhǎng)期暴露水平。
雙生子研究顯示不同個(gè)體IGF-Ⅰ水平不同，大約有40%～60%是由遺傳因素決定的[12]。在本研究中我們所檢測(cè)的微衛(wèi)星多態(tài)性CA重復(fù)位于啟動(dòng)子區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約1 kb處，而且含有特異的調(diào)控元件[13]。因此，這一多態(tài)性等位基因的改變可能導(dǎo)致IGF-Ⅰ基因轉(zhuǎn)錄的改變；或者這一多態(tài)性與其它位于啟動(dòng)子區(qū)域或其附近的多態(tài)性處于連鎖不平衡，從而影響IGF-Ⅰ mRNA的穩(wěn)定性或IGF-Ⅰ的半衰期[14]。雖然有研究顯示這一多態(tài)性與血循環(huán)中的IGF-Ⅰ水平相關(guān)聯(lián)[2]，然而我們的研究并不支持它與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)聯(lián)。但是，我們的樣本量只有約80%的效能檢測(cè)到最低OR值為2，因此，我們并不能排除這一多態(tài)性對(duì)疾病的OR值低于2的效應(yīng)，關(guān)于IGF-Ⅰ微衛(wèi)星標(biāo)記CA重復(fù)與食管鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系的最終結(jié)論還需要許多其它大的研究來確證。
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[關(guān)鍵詞] 腫瘤壞死因子；基因多態(tài)性；易感基因
[中圖分類號(hào)]R73[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2007）05（c）-004-03
腫瘤壞死因子（TNF）是體內(nèi)具有多種生物活性的細(xì)胞因子，根據(jù)其來源不同可分為兩種：TNF-α和TNF-β。它們主要是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以誘生TNF自身和IL-1、IL－6等其他細(xì)胞因子，增加HLA－I、HLA－II類抗原表達(dá)，促進(jìn)B、T細(xì)胞增殖和免疫球蛋白的合成，具有廣泛的誘導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能。編碼TNF-α和TNF-β的基因分別稱為TNF-α基因和TNF-β基因，與MHC基因緊密連鎖，TNF-α基因和TNF-β基因位于HLA-DR以及HLA-B位點(diǎn)之間的HLA-III抗原基因簇，即6p21.3[1]。
1 TNF基因多態(tài)性
TNF－α基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子及5'端非翻譯區(qū)及3'端非翻譯區(qū)組成，近來研究表明，TNF－α有16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，包括5個(gè)微衛(wèi)星、10個(gè)復(fù)等位基因和一個(gè)1C插入位點(diǎn)，其多態(tài)性位點(diǎn)已證實(shí)的有：－308、－238、＋70和－376位點(diǎn)的GA堿基變化，－863位點(diǎn)CA、－1031位點(diǎn)TC、－857及－850位點(diǎn)CT的堿基變化，其中4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域[2]。Wilson等[3]首先報(bào)道了TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第308位點(diǎn)的雙等位基因多態(tài)性，308位點(diǎn)為鳥嘌呤核苷酸G時(shí)，定義為TNF1，308位為腺嘌呤核苷酸A時(shí)定義為TNF2，TNF1較常見，TNF2較罕見。這一位點(diǎn)的突變?cè)斐闪讼拗菩詢?nèi)切酶（Nco I）識(shí)別位點(diǎn)的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被Nco I識(shí)別并切斷，即限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。另有研究表明，TNF2因能通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生更多的TNF－α，故也將其稱為TNF－α高產(chǎn)型。Wilson等的研究表明，該多態(tài)性位點(diǎn)在白色人種與HLA－DR3 連鎖不平衡相關(guān)；且－308A等位基因與HLA－DR3、A1、B8單倍型顯著相關(guān)[4]。但也有學(xué)者認(rèn)為TNF－α基因多態(tài)性是獨(dú)立于HLA之外的一類疾病風(fēng)險(xiǎn)因子，因而其表達(dá)產(chǎn)物TNF－α與HLA基因型無關(guān)。TNF－β基因多態(tài)性位點(diǎn)在第一內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游第252位點(diǎn)（＋252位點(diǎn)）的鳥嘌呤核苷酸G被腺嘌呤核苷酸A替代，這一位點(diǎn)的突變使Nco I識(shí)別序列發(fā)生了變化，致使被A所替代的核苷酸序列不能被Nco I識(shí)別并切斷。TNF－β基因多態(tài)性還包括：5'非翻譯區(qū)的一個(gè)多態(tài)性殘基、3'非翻譯區(qū)的一個(gè)EcoR I限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性、在外顯子3'處有一個(gè)替換及多個(gè)TNF微衛(wèi)星等位基因[2]。
2TNF基因多態(tài)性與有關(guān)易感性惡性腫瘤
2.1 消化道惡性腫瘤
TNF－α在肝壞死性炎癥、纖維形成、肝細(xì)胞癌變的過程中起著重要作用。Suneetha等[5]研究表明，HBV感染后肝損傷嚴(yán)重的患者和肝損傷輕微的患者中，TNF－β等位基因的分布頻率有顯著區(qū)別。嚴(yán)重肝損害患者TNF－β A/A等位基因出現(xiàn)頻率要明顯高于對(duì)照組。而TNF－α－308位點(diǎn)的基因多態(tài)性似乎與肝損傷的嚴(yán)重程度不相關(guān)。Kim等[6]的研究表明，TNF-α-308A（TNF-α-308 A/G或A/A）或－863位A缺失（TNF-α-863 C/C）變異體與HBV感染的消除有關(guān)。TNF-α單倍體1（－1 030T；－863C；－857C；－308G；-238G；－163G）和單倍體2（－1 030C；－863A；－857C；－308G；-238G；－163G）與HBV的清除、保護(hù)性抗體的產(chǎn)生相關(guān)。目前還未見有文獻(xiàn)報(bào)道TNF基因的多態(tài)性與肝癌的易感性有關(guān)，但肝炎后引起的肝損害是肝癌發(fā)病的高危因素。Lee等[7]的研究表明， TNF-α－308位點(diǎn)的基因多態(tài)性的分布頻率在胃癌組與正常對(duì)照組中無顯著性差異，且和胃癌的組織學(xué)類型無相關(guān)性。Perri等[8]研究表明，在意大利的兩個(gè)胃癌的高發(fā)地區(qū)和低發(fā)地區(qū)，TNF－α－308位的多態(tài)性和基因頻率與胃癌無相關(guān)性，并且在HP陽性組和陰性組中，TNF－α－308基因的分布頻率沒有明顯的差別。但另有研究表明，TNF－α－308A等位基因與HP感染相關(guān)。Ohyama等[9]的研究表明，TNF－α－857基因(C/C,C/T,T/T)的分布頻率在胃癌組和正常對(duì)照組中無顯著差別，TNF－α－857 T/T和HP感染與增生性胃炎相關(guān)，TNF－α－857T等位基因可能促進(jìn)胃癌擴(kuò)散。Lee等[10]分析了韓國(guó)人口中5種TNF－α啟動(dòng)子多態(tài)性(-1 031,-863,-857,-308和-238)及2種TNF－β多態(tài)性（內(nèi)含子1和蘇氨酸26天門冬酰氨）在胃癌組、十二指腸潰瘍組和正常對(duì)照組間的不同，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的多態(tài)性與胃癌和十二指腸潰瘍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)。對(duì)7種多態(tài)性進(jìn)行單倍體分析，單倍體型在對(duì)照組、胃癌組和/或十二指腸潰瘍組間區(qū)別不明顯，但個(gè)體單倍體C和D（在－1031，－863和－857位點(diǎn)上有相反的等位基因）的頻率在胃癌組和十二指腸潰瘍組間有顯著差別，這提示TNF/LTA基因型在胃癌和十二指腸潰瘍的發(fā)病機(jī)制上起完全不同的作用。
2.2 呼吸系統(tǒng)腫瘤
Selfart等[11]研究了117名肺癌患者（包括77名非小細(xì)胞肺癌患者和40名小細(xì)胞肺癌患者）和131名健康人TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態(tài)性與對(duì)照組相比有顯著性差異，而小細(xì)胞肺癌組與對(duì)照組相比則無顯著性差異。
2.3血液系統(tǒng)腫瘤
Mainoufowler等[12]報(bào)道的54例來自北歐的非霍奇金淋巴瘤LT－α＋252位多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果表明該位點(diǎn)的等位基因頻率與對(duì)照組無顯著性差異。近來，Chouchane等[13]對(duì)124例來自突尼西亞的惡性腫瘤患者進(jìn)行了研究（其中NHL 44例、乳腺癌40例、其他腫瘤40例），發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者TNF2等位基因頻率較正常對(duì)照組明顯升高，而TNF1基因型則明顯降低，提示該純合型可能是一個(gè)抑癌的保護(hù)型；相反，攜TNF1/2雜合型患者患NHL的危險(xiǎn)性增高，這一結(jié)果似乎表明TNF的多態(tài)性與NHL發(fā)生的易感性有關(guān)。但Bilkay等[14]卻得出了不同的結(jié)果，他們調(diào)查了273例來自法國(guó)的NHL患者，發(fā)現(xiàn)TNF－308位合LTα＋252位等位基因頻率與對(duì)照組相同，提示其多態(tài)性與淋巴瘤的發(fā)生無關(guān)。Demeter等[15]檢測(cè)了73例CCL的德國(guó)患者TNF－308位和LTα＋252位等位基因，發(fā)現(xiàn)CLL患者TNF1等位基因頻率明顯升高，但與疾病進(jìn)展無關(guān)，而LTα＋252位等位基因頻率患者組與對(duì)照組無顯著性差異，但在進(jìn)展期CLL患者中的該等位基因頻率增加，再發(fā)生自身免疫性溶血性貧血的CLL患者中，大部分人攜有LTα＋252位等位基因。這些研究表明，低水平的TNF－α/LTα與CLL的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與細(xì)胞因子自分泌、旁分泌有關(guān)的免疫基因在CLL的病情進(jìn)展中起作用。
2.4 泌尿系統(tǒng)腫瘤
Bilkay等[15]分析了腎細(xì)胞癌患者中TNF－α－308 G/A的基因多態(tài)現(xiàn)象和等位基因分布頻率，結(jié)果提示TNF－α－308 G/G基因型可能是保護(hù)性因素，但基因多態(tài)現(xiàn)象和等位基因分布頻率與對(duì)照組相比無明顯差別。Nakajima等[16]分析了81例來自日本的腎細(xì)胞癌患者TNF－α－238、－308、488位點(diǎn)的三個(gè)基因多態(tài)現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在－238和488位點(diǎn)GA的突變和GA基因型在晚期腎細(xì)胞癌患者中較常見，－238和488位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與腎細(xì)胞癌病程發(fā)展相關(guān)。Bong等[17]分析了73例前列腺癌患者TNF－α基因啟動(dòng)子-308位點(diǎn)及488位點(diǎn)基因多態(tài)性現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)-308位點(diǎn)GA基因型及488位點(diǎn)GA基因型在前列腺癌患者中較為多見,因此推測(cè)TNF－α基因-308位點(diǎn)及488位點(diǎn)基因多態(tài)性與前列腺癌易感性相關(guān)。March等[18]研究了膀胱癌患者中TNF－α 488及-859兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)TNF－α 488A和TNF－α-859T與膀胱癌發(fā)生密切相關(guān),并且這些基因的多態(tài)性與腫瘤分期有關(guān)。
2.5其他惡性腫瘤
Smith等[19]研究了144例女性乳腺癌患者TNF－α-308位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)-308位點(diǎn)的GG基因型比其他基因型個(gè)體更易患乳腺癌。Sarvestani等[20]研究了233名來自伊朗的女性乳腺癌患者TNF－α-308位點(diǎn)及TNF-β 252位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象,認(rèn)為這兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與乳腺癌的易感性無相關(guān)性。Duarte等[21]研究了195名進(jìn)展期宮頸癌患者TNF－α-308位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)-308AA基因型在宮頸癌患者中較為常見,然而這并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能和AA基因型在人群中較為罕見有關(guān)。Deshpande等[22]研究了宮頸癌患者TNF的11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)-572、-857、-863位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與宮頸癌的易感性相關(guān)。Skov等[23]研究了TNF－α-308位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與基底細(xì)胞癌的易感性之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)基底細(xì)胞癌的發(fā)生與TNF－α的高水平表達(dá)相關(guān),但未發(fā)現(xiàn)其易感性與此位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象有關(guān)。Pandey等[24]研究了TNF－α基因多態(tài)現(xiàn)象與肉瘤的易感性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TNF－α-308位點(diǎn)及-238位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與肉瘤的易感性之間無明顯關(guān)系。
3 結(jié)語
綜上所述,TNF基因的多態(tài)性與某些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān),由于TNF基因的多態(tài)性造成TNF轉(zhuǎn)錄水平的變化，進(jìn)而影響TNF的表達(dá),而TNF直接或間接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,因此TNF基因多態(tài)性可作為某些腫瘤易感性的遺傳標(biāo)志,隨著對(duì)TNF基因多態(tài)性與腫瘤的易感性等研究的不斷深入,必將從基因水平對(duì)某些腫瘤的病因、病理生理等方面的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生一個(gè)新的飛躍。
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【關(guān)鍵詞】Graves病；細(xì)胞間粘附因子1；基因多態(tài)
The associative study of Intercellular adhesion molecule 1’s gene polymorphism in Graves disease
LI Ying，XU Ai-mei.Qingdao Central Hospital,Shandong Qingdao 266042,China
【Abstract】 Objective To investigate the association between Intercellular adhesion molecule1(ICAM-1)with the polymorphism of it’s the forth exon G241R(721GA)and the sixth exon K469E(1405AG)and the Graves disease of Chinese Hans in northern China.Methods The serum ICAM-1 concentration and the allele of its the forth exon G241R(721GA)and the sixth exon K469E(1405AG)were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and the PCR sequence-specific primers method(PCR-SSP)in 202 Chinese Hans in northern China,including 139 patients of Graves Disease(GD).According to the age when GD occured,the GD cases were divided into two groups,the early-onset group including 78 cases(
【Key words】Graves disease;Intercellular adhesion molecule 1;Genepolymorphism
Graves病(graves dieases，GD)目前被認(rèn)為是一種器官特異性自身免疫病[1-2],有顯著的遺傳傾向，目前發(fā)現(xiàn)它與HLA類型有關(guān)[1]。ICAM-1是一條分子量約80~100ku的糖蛋白，具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，是LFA-1分子的天然配體之一，其基因定位在19號(hào)染色體上[3-4]。GD最顯著的病理組織學(xué)特點(diǎn)是甲狀腺、眼睛等效應(yīng)器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，血液循環(huán)中的淋巴細(xì)胞向效應(yīng)部位的遷徙首先是通過其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用來啟動(dòng)，二者相互作用的前提是內(nèi)皮細(xì)胞的活化，ICAM-1可以加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的活化過程[5]。
1 材料與方法
1．1 研究對(duì)象及分組
1．1．1 研究對(duì)象 202名無血緣關(guān)系的山東地區(qū)漢族人，均為青島市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科住院或門診患者及體檢健康成人，其中初診未治療GD患者139名，均具有典型的高代謝癥群，不同程度彌漫性甲狀腺腫伴或不伴甲狀腺外損害(眼征，脛前黏液性水腫)，實(shí)驗(yàn)室檢查血FT3>5．6 pmol/L，F(xiàn)T4>25．5 pmol/L，sTSH
1．1．2 分組 GD組 139例，男/女=26/103，年齡16~67歲，平均(45．24±7．26)歲。根據(jù)發(fā)病年齡分為兩個(gè)亞組：①早發(fā)GD(EGD)組：發(fā)病
正常對(duì)照(CON)組共63例，男/女=13/50，年齡18~68歲，平均(46．97±6．74)歲。
設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為第一作者實(shí)施，各項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定均由接受過專業(yè)培訓(xùn)的固定實(shí)驗(yàn)人員完成。
1．2 實(shí)驗(yàn)方法
1．2．1 受試者均于隔夜空腹抽靜脈血5 ml，室溫靜置30 min，3 000轉(zhuǎn)離心15 min，分離血清；應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光儀(德國(guó)羅氏公司生產(chǎn)Elecsys2010型)立即測(cè)定FT3、FT4、TSH、、TGAB、TPOAB。所有標(biāo)本統(tǒng)一編號(hào)保存，其余各項(xiàng)指標(biāo)均統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一批完成測(cè)定。
1．2．2 取ACD抗凝全血300 ul，用Promega公司的全血DNA抽提試劑盒，提取基因組DNA。①應(yīng)用PCR-SSP方法，擴(kuò)增包含ICAM-1基因第4外顯子721GA位點(diǎn)與第6外顯子1405AG位點(diǎn)的基因片段，同時(shí)擴(kuò)增腺瘤樣息肉基因第15外顯子的一段256 bp片段作為內(nèi)對(duì)照鏈；上游序列：兩條721位點(diǎn)和一條對(duì)照鏈上游引物：1：5'-GTGGTCTGTTCCCTGGACG-3'(代表721位點(diǎn)為G)；2：5'-GTGGTCTGTTCCCTGGACA-3'(代表721位點(diǎn) A)；3：5'-ATGATGTTGACCTTTCCAGGG-3';下游序列：兩條1405位點(diǎn)和一條對(duì)照鏈下游引物：4：5'-GCACATTCACGGTCACCTC-3'(代表1405位點(diǎn)為G)5：5'-GCACATTCACGGTCACCTT-3'(代表1405位點(diǎn)為A)6：5'-TTCTGTAACTTTTCATCAGTTGC-3';②反應(yīng)體系置于PCR擴(kuò)增儀，96℃預(yù)變性2 min，96℃變性30 s循環(huán)6次，69℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次后于72℃終延伸5 min;③2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μl，按5：1(V/V)與6×上樣緩沖液混合后，上樣與2%瓊脂糖凝膠(含0．5 μg/ml EB)，0．5×TBE中80V電壓電泳30 min，與紫外透射儀下觀察結(jié)果。用DNA Marker 作對(duì)照，可觀測(cè)到兩種長(zhǎng)度為269 bp和967 bp的擴(kuò)增片段;④電泳結(jié)果的分析：由于引物序列的特異性，對(duì)于上游序列，只在含有上游引物1的反應(yīng)體系中顯示有967 bp擴(kuò)增片段的表明721位點(diǎn)為GG基因型，只在含有上游引物2的反應(yīng)體系中顯示有967 bp擴(kuò)增片段的表明721位點(diǎn)為AA基因型，而在含有上游引物1、2的反應(yīng)體系中均顯示有967 bp擴(kuò)增片段的表明721位點(diǎn)為GA基因型；同樣分析下游位點(diǎn)，顯示1405位點(diǎn)有GG、GA、AA三種基因型。對(duì)于具體患者，共有GGGG、GGGA、GGAA、GAGG、GAGA、GAAA、AAGA(前兩個(gè)字母代表721位點(diǎn)，后兩個(gè)字母代表1405位點(diǎn))七種基因型。
2 結(jié)果
2．1 各組一般臨床資料 正常對(duì)照(CON)組與甲亢(GD)組的年齡、性別構(gòu)成比均無顯著性差異(P>0．05)、FT3、FT4、TSH、TRAB、TGAB、TPOAB均有顯著性差異(P0．05)。(見表1)。
2．2 ICAM-1基因第4外顯子721GA多態(tài)與GD的相關(guān)性
2．2．1 ICAM-1基因第4外顯子721GA多態(tài)檢測(cè)結(jié)果 在PCR擴(kuò)增結(jié)果中顯示引物1、4組或1、5組反應(yīng)體系得到片段的，證明第4外顯子721位為G等位基因；而引物2、4組或2、5組反應(yīng)體系得到片段的，第4外顯子721位為A等位基因。根據(jù)等位基因判斷具體患者的基因型有三種情況，分別為GG、GA、AA。(見表2)。
2．2．2 ICAM-1基因第4外顯子721GA多態(tài)位點(diǎn)不同基因型和等位基因與GD的相關(guān)性 GD組的三種基因型頻率與CON組無明顯差別(P>0．05)，G等位基因頻率和A等位基因頻率與CON組無明顯差異(P>0．05)；但EGD組GA+AA基因型頻率顯著高于LGD組和CON組(P
2．3 ICAM-1基因第6外顯子1405AG多態(tài)與GD的相關(guān)性
2．3．1 ICAM-1基因第6外顯子1405AG多態(tài)檢測(cè)結(jié)果 在PCR擴(kuò)增結(jié)果中顯示引物1、4組或2、4組反應(yīng)體系得到片段的，證明第6外顯子1405位為G等位基因；而引物1、5組或2、5組反應(yīng)體系得到片段的，第6外顯子1405位為A等位基因。根據(jù)等位基因判斷具體患者的基因型有三種情況，分別為GG、GA、AA。(見表4)。
2．3．2 ICAM-1基因第6外顯子1405AG多態(tài)位點(diǎn)不同等位基因與GD的相關(guān)性 GD組的三種基因型頻率與CON組無明顯差別(P>0．05)，GD組的A等位基因頻率和G等位基因頻率與CON組無明顯差異(P>0．05)； EGD組GA基因型頻率與LGD組無明顯差異(P>0．05)，EGD組與LGD組的A等位基因頻率和G等位基因頻率也無明顯差別(P>0．05)。(見表5)。
2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用（x±s）表示，各組均數(shù)之間的比較用方差分析。運(yùn)用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)樣本的群體代表性。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組等位基因頻率，各組間等位基因頻率的比較用卡方檢驗(yàn)，P
3 討論
GD的發(fā)病與遺傳密切相關(guān)，有明確的臨床資料顯示HLA-Ⅱ等位基因(DR3和DQA10501)和CTLA-4基因多態(tài)性與GD發(fā)病有關(guān)[2，6-7]。另外，基因組研究發(fā)現(xiàn)GD的其他遺傳異感基因位點(diǎn)在染色體14Q31，18Q21，20Q11以及XQ21[8-9]。
現(xiàn)在所得出的結(jié)論是基于早期關(guān)于ICAM-1基因多態(tài)性的研究。前期研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1基因多態(tài)性與多種人類自身免疫性疾病有關(guān)。外顯子4C721G-A使氨基酸鏈第241位由甘氨酸變?yōu)榫彼?外顯子6C1405A-G使第469位由賴氨酸變?yōu)楣劝彼帷，F(xiàn)已證實(shí)：ICAM-1結(jié)合點(diǎn)區(qū)(外顯子4)與第五抗原相似區(qū)(外顯子6)的基因多態(tài)性可以改變ICAM-1的特性：細(xì)胞黏附與共同趨化能力[10]。推測(cè)這種ICAM-1功能區(qū)的氨基酸替代可以改變ICAM-1結(jié)構(gòu)和功能從而影響GD的臨床表現(xiàn)?？梢蕴岣呔奘杉?xì)胞功能．其他免疫遞呈細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子(HLA及CTLA-40)的基因多態(tài)性可以影響GD的易感性和發(fā)病年齡[2，6]。
現(xiàn)已所知ICAM-1的基因多態(tài)性可以調(diào)節(jié)某些自身免疫疾病的免疫狀態(tài)[11-12]。例如：1型糖尿病、多發(fā)性大動(dòng)脈炎以及克隆氏病[13-15]。等位基因A(R241)的高表達(dá),C721GA(G241R)以相應(yīng)的自身抗體在潰瘍性結(jié)腸炎患者中發(fā)現(xiàn)[16]。另外,與研究結(jié)果相一致的是，Nishmura等發(fā)現(xiàn)ICAM-1基因的第6外顯子基因多態(tài)性與1型糖尿病的發(fā)病年齡有關(guān)[13]。移植后腎衰的患者ICAM-1基因第C.721位等位基因A是腎移植后長(zhǎng)期存活者的兩倍，受者ICAM-1E469的變異與急性的腎移植后腎衰有關(guān)[11]。
簡(jiǎn)而言之，研究結(jié)果顯示ICAM-1基因多態(tài)性可能影響甲亢的發(fā)病年齡。其原因可能是由于ICAM-1基因多態(tài)性造成氨基酸替代而影響自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)性，是ICAM-1抗原類似區(qū)與受體結(jié)合后的結(jié)果。在動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示：通過腺病毒基因技術(shù)短暫性地阻斷LFA-1/ICAM-1通路可以防止自身免疫的發(fā)生而不引起經(jīng)典的免疫抑制[17]。筆者推測(cè)這種技術(shù)可以調(diào)整ICAM-1的結(jié)構(gòu)，從而推遲GD發(fā)病年齡，延長(zhǎng)緩解期，以及對(duì)GD的臨床表現(xiàn)有一些影響。
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【關(guān)鍵詞】 進(jìn)展性卒中 VEGF936C/T 單核苷酸多態(tài)性
Correlative study on 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and advancing stroke
［Abstract］ Objective To investigate the association between 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and stroke in progression risk.Methods Using the method of restrictive fragment length polymorphism（RFLP），the VEGF genotypes of 66 stroke in progression patients，134 completed stroke patients and 100 healthy control subjects were detected.The association between VEGF 936C/T gene polymorphism and stroke in progression was compared.Results The frequency of VEGF carreiers with 936T-allele（936CT+936TT）in progression stroke patients was significantly higher than that in control group，while the frequency of VEGF 936T allele in completed stroke was similar with that in control group.There was positive association between VEGF 936T and stroke in progression（OR 1.882;95% CI 1.269～2.789）.Conclusion VEGF 936T-allele can raise the risk of stoke evolution while VEGF 936CC can decrease the risk of stroke in progression.
［Key words］ advancing stroke;VEGF 936C/T;single nucleotide polymorphisms
進(jìn)展性卒中（stroke in progression，SIP）是指卒中發(fā)病后神經(jīng)功能缺失癥狀在48 h內(nèi)逐漸進(jìn)展或呈階梯式加重。其發(fā)病率為卒中患者的30%，致殘率和致死率較一般卒中高，是影響病人預(yù)后的重要原因之一，也是腦血管病治療中的難點(diǎn)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的危險(xiǎn)因素有高血壓病、糖尿病、感染、人皰疹病毒感染和腦血管狹窄等。盡管我們對(duì)以上危險(xiǎn)因素進(jìn)行了積極的防治，仍有一部分患者會(huì)進(jìn)展。說明進(jìn)展性卒中的病因仍沒有完全闡明。遺傳、多基因、多態(tài)性這三個(gè)方面是進(jìn)展性卒中研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行遺傳性相關(guān)性研究，可以為腦卒中進(jìn)展的危險(xiǎn)性提供預(yù)示作用。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）因其可以增加血管通透性，誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)缺血部位側(cè)支循環(huán)的建立，使其成為目前缺血性疾病研究的熱點(diǎn)之一。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和缺血半暗帶細(xì)胞的壞死是進(jìn)展性卒中的發(fā)病機(jī)制。然而，發(fā)生在VEGF基因3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)936位點(diǎn)的常見突變，即C-T易位，其中，VEGF936T據(jù)報(bào)道與VEGF的低血漿水平顯著相關(guān)［1］。國(guó)內(nèi)外有研究證實(shí)，VEGF936T與乳腺癌［2］、糖尿病腎病等的發(fā)生密切相關(guān)?；谏鲜?，我們推測(cè)VEGF936C/T多態(tài)性與進(jìn)展性卒中相關(guān)?，F(xiàn)探討VEGF 936T與進(jìn)展性卒中的相關(guān)性如下。
1 對(duì)象與方法
1.1 研究對(duì)象 2005年1月～2006年1月期間哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院神經(jīng)內(nèi)科病房的住院患者200例，男107例，女93例，年齡35～75歲，平均（62±10.3）歲，排除其他腫瘤性疾病。按病變進(jìn)展情況分為普通腦梗死組134例和進(jìn)展性卒中組66例。對(duì)所有患者標(biāo)明有無進(jìn)展性卒中可能的危險(xiǎn)因素［3］（糖尿病、高血壓病、感染、腦血管狹窄＞50%、高血脂、高尿酸、高纖維蛋白原），同時(shí)選取與病例組的性別和年齡相匹配的健康志愿者100例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均為東北漢族人。
1.2 儀器與試劑 人血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）由TIANGEN-QIAGEN提供；Taq酶、dNTP、10×loading buffer、20bp DNA marker購(gòu)自Takara公司；NIaⅢ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB；VEGF引物合成由美國(guó)ABI公司完成。
1.3 方法 用RFLP法鑒定VEGF的基因型。抽取每位受檢者空腹靜脈血3ml，按照常規(guī)方法從白細(xì)胞中提取基因組DNA，4 ℃保存。PCR引物參照文獻(xiàn)［2］設(shè)計(jì)并合成，正向引物：5’-AAGGAAGA GGAGACTCTGCGC-3’，反向引物：5’-TATGTGGGTGGGTGTGTCTA CAG-3’。PCR反應(yīng)體系50 μl，包括正向反向引物各1 μl、dNTP4 μl、模板DNA 8 μl、Taq酶1 μl、ddH2O 30 μl、lodding buffer 5 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4min、95 ℃變性30s、60 ℃退火45s、72 ℃延伸45s、30個(gè)循環(huán)后、72 ℃再延伸5min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，為198bp。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NIaⅢ（New England Biolabs）5 u于37 ℃消化3 h后，再經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳鑒定VEGF基因型。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用windows SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。Hardy-Weinberg平衡和計(jì)數(shù)資料用 χ2檢驗(yàn)；通過Logistic回歸篩選進(jìn)展性卒中的危險(xiǎn)因素，優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）用來衡量卒中進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
用RFLP法鑒定VEGF的基因型，其電泳結(jié)果見圖1。VEGF 936C不被分解（198bp），而VEGF936T被分解為兩段（分別為114bp和84bp）。糖尿病、高血壓病、感染、腦血管狹窄和VEGF936T攜帶者均是進(jìn)展性卒中的危險(xiǎn)因素。病例組和對(duì)照組的基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，進(jìn)展性卒中組與普通腦梗死組基因型分布情況比較見表1；進(jìn)展性卒中組與健康對(duì)照組基因型分布情況比較見表2；普通腦梗死組與健康對(duì)照組基因型分布情況比較見表3。說明進(jìn)展性卒中組和普通腦梗死組的VEGF936 C/T基因型分布不同，不能認(rèn)為普通腦梗死組和健康對(duì)照組的VEGF936C/T基因型分布相同。進(jìn)展性卒中組VEGF936T等位基因攜帶者的頻率為50%，顯著高于普通腦梗死組的31.3%，進(jìn)展性卒中的936T等位基因攜帶者的比值比OR值為1.882，95%的可信區(qū)間為1.269～2.789，見表4。說明VEGF936T等位基因攜帶者與VEGF936CC純合子的患者相比卒中進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)性會(huì)增高1.882倍。表1 進(jìn)展性卒中組和普通腦梗死組VEGF936基因型分布的比較 表2 進(jìn)展性卒中組和健康對(duì)照組VEGF936基因型分布的比較表3 普通腦梗死組和健康對(duì)照組VEGF936 基因型分布的比較表4 進(jìn)展性卒中VEGF936T有關(guān)參數(shù)的估計(jì)值
3 討論
通過對(duì)VEGF 3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)936位點(diǎn)基因多態(tài)性在進(jìn)展性卒中組、普通腦梗死組和健康對(duì)照組中的比較，我們發(fā)現(xiàn)，936C/T突變減少了VEGF的表達(dá)，VEGF936T與進(jìn)展性卒中相關(guān)。該結(jié)果顯示，VEGF基因多態(tài)性，至少在東北漢族人中，是進(jìn)展性卒中的主要遺傳危險(xiǎn)因子；然而，我們不能排除VEGF基因的其他一些至今未知的突變，以及另外一些基因的突變?cè)谶M(jìn)展性卒中的易感性危險(xiǎn)因素中起一定作用。
VEGF可以增加血管通透性，誘導(dǎo)血管新生，同時(shí)，VEGF作為局部?jī)?nèi)生性調(diào)節(jié)劑，能夠保持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，從而避免觸發(fā)內(nèi)源性或外源性凝血途徑［4］。研究發(fā)現(xiàn)VEGF還能夠增加絲氨酸蛋白酶、纖維蛋白溶解酶、尿激酶和組織型纖溶酶原的表達(dá)和活性，從而發(fā)揮抗血栓形成作用［5］。目前國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF對(duì)缺血腦細(xì)胞DNA損害與修復(fù)具有重要影響［6］，另有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的表達(dá)，是內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)生存因素。如果VEGF的量低于閾值，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞將因?yàn)閂EGF依賴的內(nèi)皮細(xì)胞生存過程的縮短而程序性死亡［7］。因此VEGF可以通過阻止血栓進(jìn)展、溶解已形成的血栓，建立側(cè)支循環(huán)、減緩細(xì)胞凋亡等方面來防止卒中的進(jìn)展。
腦梗死時(shí)，缺氧可導(dǎo)致進(jìn)行性的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的丟失以及細(xì)胞外基質(zhì)和神經(jīng)元的壞死，這些細(xì)胞的壞死是通過凋亡發(fā)生的。在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中，多種潛在的遺傳危險(xiǎn)因素可能參與其發(fā)病機(jī)制。在進(jìn)展性卒中中，可能有VEGF的表達(dá)不足和經(jīng)VEGF受體2的信號(hào)傳達(dá)的缺陷，源于內(nèi)皮細(xì)胞受體數(shù)量的下降，或者VEGF受體/蛋白激酶活性的缺陷。影響VEGF分泌的因素有很多，VEGF936T據(jù)報(bào)道與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的低血漿水平顯著相關(guān)。缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，加速半暗帶細(xì)胞的不可逆的壞死，而缺氧誘導(dǎo)的VEGF的表達(dá)的增高可延緩內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成，促進(jìn)腦梗死的恢復(fù)，當(dāng)缺氧對(duì)腦組織的損害作用與其誘導(dǎo)的VEGF高表達(dá)對(duì)腦組織的保護(hù)作用失衡時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致進(jìn)展性卒中的形成。由此我們推測(cè)，VEGF936T攜帶者由于VEGF分泌的相對(duì)不足而導(dǎo)致了卒中的進(jìn)展。
VEGF936T等位基因者血漿低VEGF水平的確切機(jī)制至今未知。對(duì)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分析表明：VEGF936C有一個(gè)潛在的AP-4［1］（activator protein 4）結(jié)合位點(diǎn)，而936T則沒有，936位C-T突變導(dǎo)致了AP-4的潛在結(jié)合位點(diǎn)丟失。AP-4是一個(gè)螺旋環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子。它通過結(jié)合于特殊的增強(qiáng)位點(diǎn)增強(qiáng)多種基因的轉(zhuǎn)錄。AP-4的潛在結(jié)合位點(diǎn)被VEGF936C-T突變破壞也許可以解釋該突變同VEGF的低血漿水平的相關(guān)性。另一個(gè)可能的解釋是該突變同VEGF基因序列其他部位未知突變之間的連鎖性失衡。
影響VEGF分泌的因素有很多，將來各種刺激因素所誘發(fā)的VEGF的表達(dá)，與特殊基因型之間的相互關(guān)系將引發(fā)對(duì)VEGF介導(dǎo)的進(jìn)展性卒中的個(gè)體易感性的鑒別。對(duì)疾病相關(guān)性的研究也許會(huì)揭示發(fā)生在VEGF基因序列其他位置的未知的功能性突變同進(jìn)展性卒中患者之間的關(guān)聯(lián)性。
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