發(fā)布時間：2024-02-20 14:43:31
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因組學方法樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
摘要:目的 尋找一種用于群體篩查地中海貧血基因的方法。 方法 用多重PCR技術，一次反應篩出β-地中海貧血攜帶者（β°CD41/42）及α 2 基因缺失的攜帶者。 結果 在1207例黎族群體中篩出β°CD41/42（-TCTT）地貧攜帶者123例（占10%）。篩出α 2 基因全缺失212例（其中HbH病3例）。 結論 本法適合于黎族人群地中海貧血基因的篩查。
關鍵詞:地中海貧血;多重PCR;篩查
Investigation into the methods of screening thalassemia gene in LI Nationality population in Hainan.
Abstract:Objective To find a method that can be used for massively screening of thalassemia gene Li Nationality community. Methods Multiplex-PCR was used for screeningβ-thalassemia carriersβ°CD41/42）and theα 2 gene deficient carriers in a sin-gle reaction. Results Out of the1207Li Nationality samples123thalassemia carriers（accounted for10%）and212completeα 2 gene deficient carriers（including3HbH disease patients）were detected. Conclusion The method is suitable for scredning tha-lassemia gene carriers in Li Nationality population.
Key words:Thalassemia;Multiplex-PCR;Screening
地中海貧血是我國南方常見的一種遺傳性血液病，其共同特點是由于珠蛋白基因缺失或缺陷使血紅蛋白中珠蛋白鏈合成受抑制，導致血紅蛋白成分組成結構發(fā)生改變，臨床上以慢性進行性溶血性貧血為主要表現(xiàn)，輕型可無或僅有輕度貧血，重者有嚴重貧血、肝脾腫大、生長發(fā)育落后及骨骼改變等，目前除干細胞移植外尚無其他有效的根治方法。重癥患兒需輸血以維持生命，大部分患兒因輸血并發(fā)癥或嚴重貧血死于成年之前，嚴重影響家庭和兒童生活質量。海南是地中海貧血高發(fā)區(qū)，尤其在黎族人群中β-地貧的發(fā)生率高達6%～8% ［1］，且95%以上為β°CD41/42（-TCTT）突變。α-地貧基因攜帶率55.1% ［2］ ，以缺失型多見，而無論α 3.7 或α 4.2 的缺失都與α 2 基因有關，根據(jù)這些特點，設計一種在群中以篩查β°CD41/42（-TCTT）及α 2 基因為目的多重PCR技術，為海南省黎族人群優(yōu)生工作提供簡易可行的實驗方法。
1 材料與方法
1.1 樣品來源 在海南6個縣、市五個支系黎族人口選擇并簽署知情同意書的1207人（其中陵水縣343例、白沙縣265例、通什148例、保亭縣343例、東方縣149例、樂東縣144例），各取外周血0.1ml，置于含EDTA10μl在抗凝管中混勻。
1.2 群體篩查 每例標本各取抗凝血10μl用于血紅蛋白電泳和紅細胞脆性試驗（按本科室常用方法）。
1.3 DNA提取 取0.1ml抗凝血分離白細胞，按常規(guī)方法用chelex-100提取DNA樣品 ［3］ 。
1.4 PCR擴增
1.4.1 引物設計 P 1 Gen Bank HumHBA 4 編號7369-7388 5 -GCTGACCTCCAAATACCGTT-3 P 2 Gen Bank HumHBA 4 編號7548-7525 5 -CCATTGTTGGCACATTCCGGGACA-3P 3 Gen Bank HumHBGL 3 編號387-413 5 -TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTGA-3P 4 Gen Bank HumBGL 3 編號665-643 5 -TCCTATGACATGAACTTAACCAT-3P 5 Gen Bank HumBGL 3 編號1055-1074 5 -GTGTACACATATTGACCAAA-3 P 6 Gen Bank HumBGL 3 編號1477-1457 5 -AGCACACAGACCAGCACGTT-3
其中P 1 -P 2 為擴增α 2 基因引物對，擴增片段為180bp，P 3 -P 4 為擴增β°CD41/42（-TCTT）引物對，擴增片段為275bp，P 5 -P 6 為擴增正常β-鏈基因引物對，作為本試驗的內對照物，擴增片段長度423bp。
1.4.2 試劑配制 P 1 -P 2 各3.0μl、P 3 -P 4 各3.0μl、P 5 -P 6 各4.0μl;10mM dNTP10μl;10×Buffer（MBI）50μl;25mMMgCl 2 50μl;雙蒸水300μl;配成反應混合液，每管分裝20μl。
1.4.3 反應條件 取試劑20μl，樣品3μl，加入MBIE1.0U/μl配劑反應混合液94℃預熱5min，然后94℃30s，55℃40s，72℃45s，32個循環(huán)后，72℃5min延伸。
2 結果
經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，結果顯示正常者只出現(xiàn)兩條區(qū)帶一為α 2 基因的180bp區(qū)帶;一為作為實驗正常對照的β基因的423bp大小的區(qū)帶。若180bp帶缺失為α-地 2 純合子;出現(xiàn)275bp為β°CD41/42的雜合子。見圖1。
圖1 地中海貧血α 2 全缺和β°CD41/42復合體PCR擴增電泳圖（略）
1:α 2 全缺;2、4:正常;3:β41/42雜合子;5、6:α 2 全缺及β41/42復合體
在1207例樣品中檢出β°CD41/42（-TCTT）攜帶者123例，占10%;檢出α 2 基因全缺212例，占17.6%（其中HbH病例3例），至于是否左側或右側缺失再作進一步分析（另文討論）。
3 討論
地中海貧血在東南亞及我國南方發(fā)病率非常高，由于不同程度的α珠蛋白基因缺失使其表型各異，臨床表現(xiàn)不同，單個或二個α基因的缺失在臨床上癥狀輕微甚至無任何臨床癥狀及血象改變，故易被漏診。由于中國人中常見的缺失型地貧--α 3.7 、--α 4.2 和-- sea 均與α 2 基因有關 ［2］ ，因此對α 2 基因進行篩查，可檢出缺失型HbH、及左側或右側缺失型的α-地 2 基因的攜帶者，本方法雖能檢出α-地 2 基因的純合子，結合電泳圖譜可檢出缺失型HbH患者，但如進一步確診尚須鑒定左側抑或右側缺失;且本方法雖然未能檢出約5%除基因型為β°CD41/42以外的β-地貧，但可借助Hb電泳、紅細胞脆性試驗及HbA 2 定量，對疑似β-地貧患者進一步做斑點雜交法進行確診。本篩查法簡便、可靠、經(jīng)濟易行，用時可采用快速法提取DNA，可在3～4h內得到結果。因此本法適用于β°CD41/42及α-地 2 高發(fā)區(qū)人群基因篩查;對于重型地貧的預防，提高人口素質有重要的意義。
參考文獻
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關鍵詞：人類基因組 基因克隆 基因組學 結構基因組 功能基因組
人類基因組計劃（human genome project,HGP）是由美國科學家、諾貝爾獎獲得者Renato dulbecco于1986年在雜志《Science》上發(fā)表的文章中率先提出的，旨在闡明人類基因組脫氧核糖核酸（DNA）3×109核苷酸的序列，闡明所有人類基因并確定其在染色體的位置，從而破譯人類全部遺傳信息。美國于1990年正式啟動人類基因組計劃，估計到2003年完成人類基因組全部序列測定。歐共體、日本、加拿大、巴西、印度、中國也相繼提出了各自的基因組研究計劃[1]。由于各國政府和科學家的共同努力，HGP目前已在為全球范圍的合作項目；隨著數(shù)理化、信息、材料等學科的滲透和工業(yè)化管理模式的引進，HGP已真正成為生命科學領域的科學工程，基因組（genomics）作為一門新興學科也應運而生。
與此同時，科學界也在思索人類基因組計劃完成后的下一步工作，因此就有了“后基因組計劃”（post-genome project）的提法。大多數(shù)科學家認為原定于2003年所完成的人類基因組計劃只是一個以測序為主的結構基因組學（structural genomics）研究，而所謂的“后基因組計劃”應該是對基因功能的研究，即所謂的功能基因組學（functional genomics）。此外，一些新的概念如：“蛋白質組（proteome）”、“環(huán)境基因組學（environmental genomics）”和“腫瘤基因組解剖學計劃（cancer genome anatomy project,CGAP）”等等也在不斷向外延伸。
一、結構基因組學
（一）人類基因組作圖
人類基因組作圖根據(jù)使用的標記和手段不同，初期的作圖有二種：一是通過計算連鎖的遺傳標記之間重組頻率而確定它們相對距離的遺傳連鎖圖，一般用厘摩（cM）來表示；二是確定各遺傳標記之間物理距離的物理圖，一般用堿基（bp）或千堿基（kb）或兆堿基（Mb）來表示。1cM的遺傳距離大致上相當于1Mb的物理距離。隨著研究工作的進展，遺傳圖和物理圖逐漸發(fā)生整合，在此基礎上大量引入基因標記，從而形成了新一代的轉錄圖[1]。
1.遺傳連鎖圖 遺傳連鎖圖（genetic map）繪制需要遺傳標記，早期的遺傳標記主要為生化標記，20世紀80年代中期以限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、串聯(lián)重復序列拷貝多態(tài)性和小衛(wèi)星重復順序等遺傳標記為主，這類標記的數(shù)量較少，信息也較低；20世紀80年代后期發(fā)展的短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat,STR）也稱微衛(wèi)星（microsatellite,MS）標記，主要為二核苷酸重復序列，如：（CA）n，它們在染色體上分布較均勻，信息含量明顯高于RFLP，因而成為遺傳連鎖分析極為有用的標記；近年來，單個堿基的多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）標記又被大量使用，其意義已超出了遺傳作圖的范圍，而成為研究基因組多樣性和識別、定位疾病相關基因的一種新標記。
2.物理圖 物理圖（physical map）包含了兩層意義，一是獲得分布于整個基因組的30000個序列標簽位點（sequence tagged site,STS），這可使基因組每隔100kb距離就有一個標記；二是在此基礎上構建覆蓋每條染色體的大片段DNA克隆，如：酵母人工染色體（yeast ar tificial chromosome,YAC）或細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome,BAC）、人工附加染色體（human artificial episomal chromosome,HAEC）和人工噬菌體染色體（P1 bacteriophage artificial chromosome,PAC）等連續(xù)克隆。這些圖譜的制作進一步定位其它基因座提供了詳細的框架[2]。
3.轉錄圖 構建轉錄圖的前提條件是獲得大量基因轉錄本即信使核糖核酸（mRNA）的序列，人類基因組中的基因數(shù)目約在10萬左右，構建轉錄圖首先需要獲得人類基因的表達序列標簽（expressed sequence tag,EST），以此建立一張人類的轉錄圖，并與遺傳圖的交叉參照。
4.DNA序列的生物信息學 HGP一開始就與信息高速公路和數(shù)據(jù)庫技術形成了同步發(fā)展。迄今，國際上四個大的生物信息中心即美國的國家生物技術信息中心（NCBI）、基因組序列數(shù)據(jù)庫（GSDB）、歐洲分子生物實驗室（EMBL）和日本DNA數(shù)據(jù)庫（DDBJ）已經(jīng)建立和維持了源自數(shù)百種生物的互補DNA（cDNA）和基因組DNA序列的大型數(shù)據(jù)庫。這些中心和全球的基因組研究實驗室通過網(wǎng)點、電子郵件或者直接與服務器和數(shù)據(jù)庫聯(lián)系而獲得的搜尋系統(tǒng)，使得研究者可以在多種不同的分析系統(tǒng)中對序列數(shù)據(jù)庫提出質詢，這些分析包括基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質模體的鑒別、調控元件的分析、重復序列的鑒別、相似性的分析、核苷酸組成的分析以及物種間的比較等。
（二）基因組的基本結構和進化
人類基因組研究的目的，不僅為了單純地積累數(shù)據(jù)，而且要提示數(shù)據(jù)中所蘊藏的內在規(guī)律[3]，從而更好地認識生命體。近年來，隨著模式生物體測序的相繼完成和人類基因組測序速度的加快（到1999年12月已宣布完成人類第22號染色體的完全測序），特別是生物信息所提供的強有力的分析和綜合手段，使人人能夠逐漸透過浩瀚的基因組序列信息，去探索一些更為本質的問題，如：基因組的復雜度與生物進化、基因組編碼序列的結構、基因和蛋白家族、基因家族的大小及其進化。
（三）疾病的基因組學
HGP的直接始動因素是要解決包括腫瘤在內的人類疾病的分子遺傳學問題[4]，因此與人類健康密切相關。另一方面，8000多種單基因遺傳病和多種大面積危害人群健康的多基因疾?。ㄈ纾耗[瘤、心血管病、代謝性疾病、神經(jīng)疾病、精神疾病、免疫性疾病）的致病基因和疾病相關基因占人類基因組中相當大的一部分。因此，疾病基因的定位、克隆和鑒定是HGP的核心部分。
20世紀90年代之前，絕大多數(shù)人類遺傳性疾病的原發(fā)生化基礎尚不清楚，無法用表型-蛋白質-基因的傳統(tǒng)途徑進行研究。在HGP的遺傳和物理作圖帶動下，出現(xiàn)了最初被稱為“反求遺傳”、90年代初又改稱為“定位克隆法”的全新思路。該思路的關鍵內容是：應用細胞遺傳學定位和家第連鎖分析方法，首先將疾病基因定位于染色體的特定位置，然后通過進一步的遺傳和物理作圖，使相關區(qū)域壓縮至1Mb之內，此時即可構建YAC、BAC、PAC、HAEC或粘粒（comid）等克隆重疊樣，從中分離基因，并在正常人和患者的DNA中進行結構比較，最終識別出疾病基因。包括囊性纖維化、Huntington舞蹈病、遺傳性結腸癌、乳腺癌等一大批重要疾病的基因是通過“定位克隆”發(fā)現(xiàn)的，從而為這些疾病的基因診斷和未來的基因治療奠定了基礎。隨著人類基因圖的日臻完善，一旦某個疾病位點被定位，即可從局部的基因圖中遴選出結構、功能相關的基因進行分析，將大大提高疾病基因發(fā)現(xiàn)的效率。
目前，人類疾病的基因組學研究，已深入到多基因疾病這一難點。多基因疾病難以用一般的家系遺傳連鎖分析取得突破，需要在人群和遺傳標記的選擇、數(shù)學模型的建立、統(tǒng)計方法的改進等方面進行不斷的探索。
二、功能基因組學
HGP當前的整體發(fā)展使功能基因組學提到了議事日程[5]，出現(xiàn)了結構和功能基因組學向功能基因組學過渡、轉化的過程。一般認為，在功能基因的組研究中可能的核心科學問題有基因組的多樣性和進化規(guī)律；基因組的 表達及其調控；模式生物體基因組研究等。
（一）基因組多樣性
人類是一個具有多樣性的群體，不不同群體和個體在生物學性狀以及在對疾病的易感性/抗性上的差別，反映了進化過程中基因組與內、外環(huán)境相互作用的結果。開展人類基因組多樣性的系統(tǒng)研究，無論是對于了解人類的起源和進化，還是對于醫(yī)學均會產(chǎn)生重大的影響。各種常見多因素疾病（如：高血壓、糖尿病和精神分裂癥等）相關基因的研究將成為功能基因組時代的研究熱點。除了利用多態(tài)性遺傳標記進行精細定位這一傳統(tǒng)途徑，也將采用基因組水平再測序的方法直接識別變異序列，即選取一定數(shù)量的受累和未受累個體，對所有疾病相關或候選基因的全序列（或其編碼區(qū)）進行再測序，準確定位其變異相關標記位點。同樣，腫瘤研究也需要對腫瘤相關基因進行大規(guī)模的再測序。
（二）識別人類基因的共同變異
已知大多數(shù)人類基因的等位基因數(shù)量是有限的，常僅有2～3種。形成這種遺傳多樣性局限性的原因，很有可能是因為現(xiàn)代人類來源于一個相當小的群體，這有助于揭開許多疾病敏感性的奧秘。如：載脂蛋白E基因有三種主要變型（E2、E2和E4），可以解釋老年癡呆癥和心血管疾病的風險性；血管緊張素原轉換酶（ACE）與心血管疾病一定相關性；化學趨化因子受體CKR-5在一定程度上影響對人類免疫缺陷病毒（HIV）的敏感性等。非編碼區(qū)對評價疾病風險也是重要的，精確定位非編碼區(qū)變異的方法可以是對調控區(qū)域變異的系統(tǒng)性篩查，也可利用精密遺傳圖在人類群體中識別祖先染色體節(jié)段。
三、藥物基因組學
基因組多樣性也在一定程度上決定了人體對藥物的反應，通過對影響藥物代謝或效應通路有關基因的編碼序列的再測序，有可能提示個體對藥物反應差異的遺傳學基礎，這就是“藥物基因組學”（pharmacogenomics）的主要內容[6]；以此作為延伸，提示個體對環(huán)境反應差異的遺傳學基礎的環(huán)境基因組學也已露端倪。
四、蛋白質組學
蛋白質組學是要從整體上研究蛋白質及其修飾狀態(tài)。目前正在發(fā)展標準化和自動化的二維蛋白質凝膠電泳的工作體系，包括用一個自動系統(tǒng)來提取人類細胞的蛋白質，繼而用色譜儀進行部分分離，再用質譜儀檢測二維修飾，如：磷酸化和糖基化。此外，也有人在設計和制作各種蛋白質生物芯片；蛋白質的另一個重要工作內容是建立蛋白質相互作用的系統(tǒng)目錄。生物大小即蛋白-蛋白和蛋白-核酸之間的互作構成了生命活動的基礎，這些互作有可能以通用的或特殊的“陷井”（如：酵母雙雜交系統(tǒng)）加以識別[7]。
總之，基因組學正方興未艾，其現(xiàn)實意義和深遠意義已得到全體人類的共識，預期在不遠的將來，人類基因組學將對人類的健康、計劃生育、優(yōu)生優(yōu)育產(chǎn)生重大影響。
參考文獻
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關鍵詞：分子生物學；植物抗性基因；基因組
生物學研究正進入一個前所未有的新時期。大量數(shù)據(jù)、信息的獲得，使得生物學研究各領域均有很大轉變，其中包括植物抗性基因的研究。目前基因組研究已開始對植物生物學產(chǎn)生深遠的影響，再過數(shù)年，人們將從當前的描述性研究很快過渡到從已有的大量數(shù)據(jù)信息中提出假說，經(jīng)計算機模擬分析，最后針對性地設計實驗來驗證新的基因分析方法。實驗將不再僅僅是分析基因――基因、蛋白質――蛋白質的相互作用，而是將獲取大量的RNAs，蛋白質和相關代謝物等數(shù)據(jù)。
1 植物抗性基因研究現(xiàn)狀
1.1 植物自身抗性基因以等位基因系和基因簇形式存在
經(jīng)典遺傳學研究表明，在不同植物品系的同一基因位點上可能具有等位基因，這些等位基因對各種病原具有不同的特異性。此外，抗性基因往往在某一特定區(qū)域成簇存在。事實上，在特定的染色體區(qū)域常常不能分辨抗性基因位點上真正的等位基因和有關聯(lián)的成簇基因。利用具有不同抗性基因的植物進行雜交可以澄清這一問題。
1.2 植物抗性基因的作用機制
Flor是第一個在植物和病原中同時研究抗性遺傳的植物病理學家，他研究亞麻和亞麻銹病病菌之間的相互作用。通過這些研究，他提出了基因對基因假說。研究表明，植物和病原的遺傳組成和一株植物成功地進行防御是密切相關的。植物―病原相互作用的專一性是由病原的一個顯性無毒基因產(chǎn)物和植物抗性基因產(chǎn)物間相互作用來決定的。因此，這兩個產(chǎn)物之間特異識別是植物抗性作用的基礎。這種識別觸發(fā)了進一步的生理防御作用并導致超敏細胞死亡和對病原具有毒性的分子的積累。
1.3 植物抗性基因克隆
植物抗性基因的克隆目前主要采用轉座子標記和定位克隆的方法，迄今為止，用這2種方法已克隆出22種抗性基因，其中用定位克隆方法得到16種，用轉座子標記法得到6種。最近，有人又提出利用抗性基因類似序列（resistancegeneanalogs）通過PCR來特異擴增抗性基因的方法。
1.4 轉基因改良植物脅迫耐性的困難及改進措施
盡管轉基因改良植物脅迫耐性已取得一些進展，目前仍存在以下困難：目的產(chǎn)物表達量不夠或時空表達不協(xié)調；目的產(chǎn)物翻譯后修飾（加工或折疊）不適當，影響功能表達；目的酶所催化的代謝反應前體物質不足；細胞內目的酶活性受制于pH、溫度及鹽離子濃度等因素；有些目的表達產(chǎn)物對宿主細胞產(chǎn)生毒副作用等。進一步改進措施有以下幾方面： ①選用來自近緣物種的目的基因；②構建高效表達體系；③表達產(chǎn)物的胞內區(qū)域化；④增加目的酶催化的前體物質含量；⑤目的產(chǎn)物翻譯后修飾的調控；⑥抑制目的產(chǎn)物的副效應。
2 植物抗性基因研究趨勢
基因的研究是指在許多基因同時存在的基礎上對多個基因同時進行研究，分析各自與它們之間的結構與功能的相互關系。因而它至少涉及3個相關領域：結構基因組――主要關心DNA堿基序列水平上的基因結構；比較基因組――尋找種內、種屬間產(chǎn)生基因結構差異的分子基礎，以期獲取與目的性狀相關的基因；功能基因組――著重研究基因與其表達產(chǎn)物及功能活性的調控關系。結構基因組是其它領域的基礎，比較基因組為功能基因組研究提供等位基因，蛋白質組則是在蛋白質水平上分析基因表達的功能基因組研究的派生分枝。生物信息學是在前面3者研究的基礎上，獲取、整理、綜合分析提取大量已有復雜生物數(shù)據(jù)的新學科，對相關學科的研究有很大的推動作用。
基因組學（Genomics）的出現(xiàn)，使生物學研究進入一個新的時期，即由僅對一個基因的研究轉向在基因組規(guī)模上同時對大量基因的結構和功能進行系統(tǒng)的研究。無論從思想上還是技術方法上，基因組學已經(jīng)影響生命科學的各個領域，植物的抗逆性研究也不例外。利用基因組學的方法，不但可以挖掘大量的抗性基因，對其功能進行詳細的研究，而且有助于全面理解植物的抗逆機理，為利用遺傳工程提高植物抗性提供基礎。
以基因組為研究對象的基因組學是常規(guī)的以基因為對象的分子生物學研究的一次飛躍。已有報道說明，基因組學方法在植物抗逆研究中的應用處于起步階段，但隨著基因組學研究的發(fā)展，我們獲得大量與抗逆性有關的序列信息和生物功能信息，從而對植物抗逆復雜性會有更全面的理解。植物的抗逆性能往往不是由單基因決定的，而是由一系列相關的直接或間接作用的基因形成一個復雜的調控網(wǎng)絡。在這個復雜的調控網(wǎng)絡中，任何一個環(huán)節(jié)都可能是至關重要的。因而對植物抗逆性的提高，尤其對一些屬數(shù)量性狀的抗逆性，僅靠轉移一個基因得到耐逆植物有一定的難度，轉入一系列基因也許是必需的，即利用基因組工程，而不只是基因工程來提高植物抗性?；蚪M學的研究為植物抗逆遺傳工程提供大量的全新基因，從而為抗逆育種提供了更廣闊的前景。
3 展望
我們正經(jīng)歷一個快速發(fā)展的階段，與幾年前相比，已有許多那時想都不敢想的工具與能力。目前已開始從單個抗性基因的鑒定克隆轉移到抗性基因表型的全面分析?？梢灶A測，在不久的將來，不用通過實驗鑒定，我們在計算機上通過序列比較和功能模擬分析，就能預測新克隆的抗性基因的功能。大規(guī)模的新方法、新技術的應用，將為我們獲取新抗性基因并使之變成可操作利用提供機會。
參考文獻
1 閻隆飛，張玉麟.分子生物學[M].中國農(nóng)業(yè)大學出版社， 1997
關鍵詞:食品安全檢測;蛋白組學;代謝組學;基因組學
1前言
民以食為天,食以安為先。食品安全關系人類健康,一直以來,都是全球關注的熱點。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,一方面,隨著生活水平不斷提高,公眾對食品安全越來越重視,要求也越來越高;另一方面食品工業(yè)快速發(fā)展,國際食品貿易日趨頻繁,食品安全問題已呈現(xiàn)全球化模式。威脅食品安全的因素不僅僅有傳統(tǒng)的化學危害物、食源性致病菌;采用劣質原料生產(chǎn)高貨值食品、以次充好、以假亂真、產(chǎn)地造假、成分造假等等問題,是目前食品安全面臨的新挑戰(zhàn)。目前,已知危害物的檢驗技術已經(jīng)比較成熟;未知、潛在的食品安全危害物偵別及成分鑒定、產(chǎn)地鑒定等,是食品安全檢測技術面臨的難題。食品安全檢測迫切需要新的方法和手段來解決這些難題和挑戰(zhàn)。組學是最近幾十年發(fā)展起來的新學科,主要包括基因組學(Genomics)、蛋白組學(Proteinomics)、代謝組學(Metabolomics)、轉錄組學(Transcriptomics)、脂質組學(Lipidomics)、糖組學(Glycomics)等等。其中,基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學共同構成了“系統(tǒng)生物學”[1-2]。組學技術的基本思路是通過研究成千上萬的DNA、RNA、蛋白質或者代謝物等物質,找出與某一生命過程相關的特征蛋白、DNA、RNA或者代謝物,進而對某一目標進行評估。組學技術依托高通量、高分辨率、高精度的現(xiàn)代化分析儀器,通過海量數(shù)據(jù)處理,進行信息提取和結果分析。近年來,組學技術與食品安全檢測不斷融合,在食品安全檢測領域發(fā)揮著越來越重要的作用。
2與食品安全檢測相關的組學技術
2.1蛋白組學。蛋白組學研究特定狀態(tài)下蛋白整體水平的存在狀態(tài)和活動規(guī)律,是從分子水平上來分析蛋白質的表達、修飾、功能等的一門學科。蛋白組學的研究對象涉及植物、動物、微生物等,其在藥物開發(fā)、病理研究、食品安全等方向都有諸多應用。蛋白質可以作為食品組分的特征標記物,因此蛋白組學可以用于食品安全檢測[3]。蛋白組學的研究手段主要有凝膠技術和質譜技術,質譜可以對肽段和蛋白進行表征和測序,是分析蛋白的重要技術。通過蛋白酶解后得到肽段的肽指紋圖譜結合質譜技術,可以分析某一種或同類食物的蛋白質成分[4],經(jīng)過比較和篩選,確定特征標志蛋白或者肽?；趯Φ鞍谆蛘唠牡姆治?質譜技術可以獲得食品組分的特定指紋信息,實現(xiàn)定性分析。一旦獲得蛋白標志物或者肽標志物,即可用液相色譜-質譜的選擇反應監(jiān)測(SRM)或者多反應監(jiān)測(MRM)模式對目標物進行快速、靈敏的定量分析檢測。2.2代謝組學。代謝組學以生命體的代謝物為研究對象,主要研究分子量1000以下的小分子[5-6]。根據(jù)研究對象不同,代謝組學可以分為研究已知化合物的靶向代謝組學和分析未知化合物非靶向代謝組學。代謝組學作為新興的研究技術已應用在食品安全、藥物研發(fā)、疾病診斷、環(huán)境科學和植物育種等方面[7]。代謝組學的主要研究手段包括核磁共振技術(NMR)和質譜技術。質譜技術以高通量、高靈敏度著稱,飛行時間質譜和高分辨質譜是代謝組學研究中經(jīng)常用到的儀器;NMR技術具有非破壞性的優(yōu)點,可以對研究對象內部化學變化和生化反應進行跟蹤[8-9]。常見的代謝物主要有極性化合物(例如有機酸、氨基酸、糖、胺)、脂類、類萜和固醇。代謝組學分析得到的數(shù)據(jù)量巨大,需要借助化學計量學對數(shù)據(jù)進行分析處理,常用的分析方法包括主成分分析(PrincipalComponentsAnalysis,PCA)、判別分析(DiscriminantAanalysis,DA)、偏最小二乘法-判別分析(PartialLastSuares-DiscriminantAeqnalysis,PLS-DA)等方法[10]。2.3基因組學?；蚪M學的研究對象包括基因組的結構、功能、進化、定位、編輯等,以及他們對生物體的影響?；蚪M學通過使用高通量DNA測序和生物信息學來組裝和分析整個基因組的功能和結構。近幾十年來,多重聚合酶鏈式反應、基因測序、基因芯片等技術飛速發(fā)展,為基因組學在食品安全領域的應用打下了良好的基礎?；诨蚪M學特異性強、靈敏度高和高通量的特點,其在病原微生物檢測,物種鑒定和轉基因食品檢測方面有著很多應用[11-12]。
3組學技術在食品安全檢測中的應用
3.1食品中有害物質檢測。食品中不含危害人類健康成分是食品安全的最基本要求。組學技術在檢測食品中有害物質方面有著廣泛的應用。隨著生活水平的提高,動物源性食品的需求量快速增加。經(jīng)濟利益驅使下,為了規(guī)避食品安全法規(guī)中已有獸藥的使用限制,使用新獸藥的情況時有發(fā)生。傳統(tǒng)方法只針對目標化合物進行檢測,對于非目標化合物即新型獸藥的檢測無能為力。采用組學方法,尋找合適的生物標志物,可以及時發(fā)現(xiàn)新型獸藥的使用情況。Courant等[13]采用液相色譜-高分辨質譜和非靶向代謝組學技術,建立了監(jiān)測小牛尿液中β2-受體激動劑代謝物的方法,有望成為篩查各類β2-受體激動劑獸藥的有效方法。Regal等[14]應用代謝組學技術結合高效液相色譜-高分辨質譜結合多元變量統(tǒng)計分析,找出了牛血清中外源性雌二醇和孕酮的生物標志物,為檢測動物養(yǎng)殖過程中的激素濫用提供了新方法。發(fā)酵食品中含有豐富的微生物和各種有益消化酶,具有獨特的風味和較高的營養(yǎng)價值,深受大眾喜愛。生物胺和亞硝酸鹽是食品發(fā)酵過程中常見的兩類有害物質。生物胺包括芳香胺(酪胺、苯乙胺、多巴胺等)、脂肪胺(腐胺、精胺、亞精胺等)和雜環(huán)胺(組胺、色胺等),主要來源于發(fā)酵過程中的微生物降解。亞硝酸鹽是發(fā)酵食品中重要的危害物質;發(fā)酵過程中,微生物分泌硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原產(chǎn)生亞硝酸鹽。Meyer等[15]利用液相色譜法和主成分分析相結合的代謝組學方法,研究了發(fā)酵香腸中的生物胺和亞硝酸鹽含量。用該方法對101個樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)其中NaNO2的濃度均低于20mg/kg,生物胺含量普遍很低,僅在一個樣品中發(fā)現(xiàn)尸胺和腐胺濃度達到了中毒水平。3.2組學技術在食源性致病菌檢測中的應用。食源性致病菌是食品安全面臨的最嚴峻挑戰(zhàn)之一,傳統(tǒng)檢測方法從細菌培養(yǎng)到細菌計數(shù),檢測一個樣品至少需要4~5d的時間,而組學技術可大大提高食源性致病菌檢測的效率。代謝組學在沙門氏菌和大腸桿菌的鑒定方面已經(jīng)取得一定成果[16-18]。Xu等[16]利用氣相色譜-質譜法和一種多元算法進行了鼠傷寒沙門氏菌污染豬肉和自然變質豬肉中代謝物的分析,確定了17種代謝產(chǎn)物(包括各種類型的氨基酸和脂肪酸),以區(qū)分被致病微生物污染的豬肉。Cevallos等[18]建立了基于代謝組學檢測大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌的方法,根據(jù)對細菌代謝物的分析,此方法可以在18h內快速檢測以上兩種病原體,在牛肉和雞肉中大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌檢測水平均可以達到7±2CFU/25g。Whiteside等[19]給出了大腸桿菌的在線基因組學預測平臺SuperPhy,該平臺整合了所有可以公開獲得的大腸桿菌基因組分析工具和基因組序列數(shù)據(jù),可以用于臨床醫(yī)學、流行病學、生態(tài)學和進化領域等領域,亦可應用于食品安全檢測領域。祝儒剛等[20]運用多重聚合酶鏈式反應結合基因芯片技術,建立了一種檢測大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌5種食源性致病菌的方法,該方法快速、準確、靈敏。全基因組測序(WholeGenomeSequencing,WGS)廣泛應用于食源性致病菌特征分析,在確定污染事件根源、食品安全事件溯源、食品安全突發(fā)事件檢測和鑒定,以及毒力和致病性特征分析方面,WGS技術發(fā)揮著越來越重要的作用[21-22]。3.3食品摻假及欺詐的研究。食品摻假、欺詐是世界性問題[23]。據(jù)估算,全球食品行業(yè)每年由于食品摻假和欺詐帶來的經(jīng)濟損失高達150億美元[24]。當前,與食品摻假相關的議題包括產(chǎn)地、品種、生產(chǎn)方式、未宣布成分、物種替代等[25]。有關食物的完整、準確和真實的信息不僅是消費者的迫切需求,也是行業(yè)和政府的迫切需求。運用組學技術對食品進行檢測,可以確保食品從農(nóng)場到餐桌的真實性。與傳統(tǒng)檢測方法項目比,組學技術在檢測食品摻假和欺詐方面具有天然優(yōu)勢。通過高通量的檢測模式,對樣品中的蛋白質、代謝物或者DNA進行檢測,通過對大量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理、甄別食品特性,進而可以確定食品產(chǎn)地、品種、成分、物種及生產(chǎn)方式等諸多與食品摻假相關的要素。運用特征標記肽段可以檢測馬肉、牛肉、羊肉和豬肉[26]。MontowskaFornal[27]采用液相色譜-串聯(lián)質譜方法,選擇了20個熱穩(wěn)定肽段,可以有效區(qū)分豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉、鵝肉,在實際樣品檢測中,從禽肉腸中檢出含量僅為0.8%的牛肉成分。基于氣相色譜技術,運用代謝組學分析方法可以有效區(qū)別冷凍豬肉和新鮮豬肉[28]。乳品行業(yè)中,牛乳冒充羊乳,奶粉調制的復原乳冒充鮮奶,工業(yè)化生產(chǎn)的奶酪冒充手工奶酪的欺詐行為極其常見。Caira等[29]應用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行分析,根據(jù)酪蛋白的特征肽可以有效鑒別水牛乳、牛乳、牛初乳和乳酪。一種結合肽和蛋白質譜的方法可以有效檢測水牛乳、羊乳中的牛乳,判斷鮮牛奶中是否加入奶粉[30]。根據(jù)靶向DNA的高特異性,運用基因組學的方法也可以準確鑒別牛乳、水牛乳、羊乳等等,但是準確定量還有一定的難度[31-32]。Majcher等[33]利用氣相色譜-質譜結合代謝組方法以及化學計量學數(shù)據(jù)處理方法,可以準確鑒別傳統(tǒng)手工藝制作的奧西佩克奶酪和工業(yè)化生產(chǎn)的奧西佩克奶酪。蜂蜜是很受消費者歡迎的食品。不同種類花的蜂蜜不僅口感不同,其營養(yǎng)價值和價格也大不相同。Jandric等[34]利用代謝組學方法,結合液相色譜-質譜,傅里葉變換紅外光譜等手段,建立了鑒別三葉草、麥盧卡、拉塔、卡瑪西四種新西蘭蜂蜜的方法?；蚪M學方法也可以提取蜂蜜中的物種特異性信息,確定蜂蜜的植物學和昆蟲學起源,從而鑒定蜂蜜真?zhèn)蝃35-36]。組學技術可以準確鑒別葡萄酒真?zhèn)巍a(chǎn)地。采用基因組學技術,對DNA來源進行分析,可以鑒別葡萄酒真?zhèn)蝃37]。采用蛋白組學方法,MALDI-TOF-MS技術可以準確鑒別33種克羅地亞白葡萄酒[38]。采用代謝組學技術,通過對葡萄酒中揮發(fā)物的分析,即可判斷釀酒葡萄的品種和產(chǎn)地[39]。利用代謝組學方法還可以將有機種植的胡蘿卜[40]和大麥[41]與普通的胡蘿卜和大麥區(qū)別開來。代謝組學方法可以對咖啡質量和來源進行評價,阿拉卡比咖啡質量要好于羅布斯塔咖啡,在阿拉卡比咖啡中摻入羅布斯塔咖啡也是常見的咖啡造假手段,核磁共振技術可以檢測低至2%的羅布斯塔咖啡[42]。使用單核苷酸多態(tài)性基因分型可以確定5個最常見的希臘橄欖油品種[43]?；蚪M學和代謝組學技術均可以檢測橄欖油中是否摻入玉米油、大豆油、葵花籽油、花生油等其他食用油。[44-45]3.4轉基因食品的檢測。轉基因技術通過生物工程技術將一種或幾種外源性基因轉移到某種特定的生物體內,使其表達出相應產(chǎn)物,以轉基因生物為原料加工生產(chǎn)的食品就是轉基因食品。關于轉基因食品的安全性,目前仍存在爭議。Tan等[46]應用蛋白組學技術研究了轉基因玉米和非轉基因玉米的蛋白質組差異,結果發(fā)現(xiàn)兩者之間存在148個差異表達的蛋白質,其中42個在轉基因玉米中表達較高,106個在非轉基因玉米中表達更高。基于液相色譜-質譜技術自上而下的蛋白質組學技術,可以檢測抗草甘膦玉米(NK603)中117種蛋白質表達變化[47]。轉基因玉米的代謝組學分析中[48],抗草甘膦玉米(NK603)的幾種胺類代謝物(例如:尸胺、腐胺、N-乙酰尸胺、N-乙酰腐胺)相比非轉基因玉米有顯著提高。Catchpole等[49]啟動快速代謝組“指紋圖譜”,比較了轉基因土豆和非轉基因土豆的總代謝物,發(fā)現(xiàn)轉基因土豆與傳統(tǒng)品種差異不大。代謝組學技術也已應用到對轉基因大米[50,51]、轉基因番茄[52]等轉基因食品的分析。實時PCR(real-timePloymeraseChainRactione,rtPCR)是歐盟法規(guī)規(guī)定的評估轉基因食品的唯一有效方法。微滴式數(shù)字PCR技術(dropletdigitalPCR,ddPCR)可以對食品中的植物源轉基因成分進行分析[53]。Kosir等人結合基因步行(GeneWalking,GW)和下一代基因測序技術,可以同時檢測混合物中低至1%的轉基因玉米(MON810、MON89034、MON88017)和棉籽(MON1595)[54]。
（青年俊才候選人）。主要從事魚類比較基因組學和群體基因組學研究。迄今在BMC Biology、Molecular Biology and Evolution、Molecular Ecology等國際知名學術期刊發(fā)表學術論文20余篇。
魚類幾乎占領了地球上所有水域中的生態(tài)位，既是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分和生物資源，也是重要的科學研究對象?！爸袊聂~類研究具有源遠流長的歷史。遺憾的是，目前斑馬魚、青、刺魚、鱺魚等成為模式生物的魚類，都是由外國學者所倡導和建立的。某種角度上中國的魚類研究缺少自己的標簽?！惫鶎毘烧f。10多年來，郭寶成遨游在魚類世界里，他的身影穿梭在實驗室里、野外采樣現(xiàn)場、講臺上、學術報告會議上，忙碌而又充實。
始于興趣，享受科研
“早在中山大學讀本科的時候，受益于本科生導師制，師從魚類生理學家和魚類養(yǎng)殖學家林浩然院士?！惫鶎毘删褪沁@樣跟魚結了緣。
興趣使然，研究生時期，郭寶成選擇就讀于中國魚類學研究中心――中國科學院水生生物研究所，師從中國魚類分子系統(tǒng)學與生物地理學的杰出研究者――何舜平研究員。郭寶成回憶說：“何老師給了我極大的學術自由，寬松自由的學習氛圍使我感受到了科研是一種享受?！?/p>
同時，郭寶成也深刻感知到科研容不得半點浮躁，并且在之后的科研道路上用自己的行動踐行著這一箴言?！昂卫蠋熆偸歉嬲]我們要把有限的時間和精力都投入到實驗室和科研項目上。很多老院士、老科學家，他們一輩子就專注于做一件事?！惫鶎毘梢矆孕牛懈冻鼍蜁谢貓?，你的付出即便現(xiàn)在看不到回報，但在未來一定會反饋給你。
2010年，郭寶成順利拿到了中國科學院水生生物研究所水生生物學博士學位，5年的碩博連讀使他在魚類分子進化領域得到了系統(tǒng)的訓練與積累，但是郭寶成卻希望能夠繼續(xù)深造，開闊學術視野。“在魚類研究領域，國外無論是在理論上，還是在實際應用中，都有很多值得學習的地方?！辈┦慨厴I(yè)后，郭寶成先后在瑞士蘇黎世大學和芬蘭赫爾辛基大學繼續(xù)從事有關魚類進化基因組學的研究。
國外6年的科研歷程使郭寶成建立了廣泛的學術交流網(wǎng)絡，瑞士蘇黎世大學的Andreas Wagner教授、芬蘭赫爾辛基大學的JuhaMerila教授、德國明斯特大學的Erich Bornberg-Bauer教授、英國皇家學會院士牛津大學的 PerterHoland教授、加拿大麥吉爾大學的Frederic Chain博士、芬蘭赫爾辛基大學的Zitong Li博士都是郭寶成科研路上的合作者。
“其實，科研是沒有國界、不分領域的。我和很多科學研究者都素未謀面，但是我們通常會用e-mail進行交流，共同的興趣愛好驅使我們走到一起。比如，我在瑞士的導師提倡‘idea-driven’，他的實驗室里有做魚的、做酵母的、做老鼠的，大家的研究對象不盡相同，但總是可以相互學習借鑒?！惫鶎毘烧f。
勇于開拓，解鎖魚類基因進化密碼
基因（M）重復作為普遍存在的生物學現(xiàn)象，是基因組和遺傳系統(tǒng)多樣化的重要推動力量。重復基因的功能分化一直是研究熱點，也是郭寶成的研究內容之一。通過數(shù)據(jù)挖掘，郭寶成發(fā)現(xiàn)已有的研究大都集中于重復基因序列堿基變異，插入缺失對重復基因的影響是研究中的“缺口”。因此，他決定以在進化過程中，基因（組）重復尤其突出的魚類為研究對象，系統(tǒng)研究插入缺失對重復基因分化的影響。
郭寶成發(fā)現(xiàn)重復基因比單拷貝基因積累了更多的插入缺失，重復基因兩個拷貝均有插入缺失積累，缺失的積累要比插入的積累普遍，插入缺失傾向積累于蛋白質二級結構的環(huán)結構域及三級結構的表面，重復基因兩個拷貝間的序列分化程度與其插入缺失積累密度呈顯著的正相關，插入缺失而非堿基變異是重復基因兩個拷貝間蛋白四級結構分化的主要原因。通過總結上述研究成果，郭寶成提出了插入與缺失是重復基因進化的重要動力。研究結果發(fā)表于國際知名分子進化刊物Molecular Biology and Evolution，受到編輯與審稿人的高度認可。
生物適應性進化的遺傳基礎是生物學研究的基本問題，了解生物適應性進化的遺傳基礎，對于生物多樣性的保護以及資源的可持續(xù)利用至關重要。因此，郭寶成以魚類海水向淡水的適應為其研究的切入點。
已有研究表明，環(huán)境因子是方向性選擇的重要動力，因此具有非常高鹽度和溫度梯度變化的波羅的海為研究海洋魚類群體分化提供了天然的實驗室。通過對波羅的海中三刺魚和鯡魚群體的研究，郭寶成發(fā)現(xiàn)，遺傳分化發(fā)生在三刺魚和鯡魚的整個基因組范圍；而鹽度和溫度的變化是波羅的海三刺魚和鯡魚遺傳分化的動力。為海洋魚類群體分化及局部適應（local adaptation）提供了確鑿的證據(jù)，研究成果發(fā)表在BMC系列旗艦刊物BMC Biology和分子生態(tài)學代表性刊物Molecular Ecology上，發(fā)表一年來已受到數(shù)十次引用。積跬步，以至千里
“促進和提高中國的魚類進化研究”，這是長久以來縈繞在郭寶成內心的聲音。2016年，郭寶成作為中國科學院動物研究所“百人計劃―青年俊才”候選人從芬蘭歸來。在未來幾年里，一方面，他將以前期的研究成果為切入點，繼續(xù)深入研究插入與缺失在重復基因功能分化中的作用及其在魚類物種分化中可能的作用；另一方面，為了研究生物進化的重復性和可預測性，郭寶成擬以發(fā)生適應輻射的刺魚類群為研究對象，運用群體基因組學和比較基因組學的方法，研究全球范圍內，刺魚從海水向淡水適應輻射過程中，種內平行進化與種間趨同進化的遺傳基礎，從而進一步揭示適應輻射發(fā)生遺傳機制的一般規(guī)律。郭寶成已經(jīng)逐步組建起了屬于自己的魚類進化與基因組學研究團隊，并且得到了國家自然科學基金的資助。
在開展科學研究的同時，郭寶成深知科研平臺在創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)中蘊含著巨大的潛力。他說：“人才培養(yǎng)工作是科學研究的重中之重，畢竟科研最終是要由人完成的。就魚類研究在國內的發(fā)展來看，我們應該以人為本，培養(yǎng)一批以魚類為研究對象，掌握分子與細胞生物學、遺傳學、基因組學以及生物信息學技術的復合型人才，以此帶動我國魚類研究的發(fā)展。”目前.郭寶成的中國科學院動物研究所魚類進化與基因組學研究團隊已經(jīng)納入了1名博士后、1名博士生和2名碩士研究生，并且正在逐步擴展當中。
在具體的科研人才培養(yǎng)工作中，郭寶成認為，學生獨立思考與動手能力是并重的。他說：“作為學生科研道路上的指引者，我們既要培養(yǎng)學生的獨立思考能力，組織學生參加各種學術會議，開拓眼界，又要培養(yǎng)學生動手解決科學問題的能力。獨立思考能讓學生知道什么是科學研究的重要問題或者亟待解決的問題，而動手能力則為問題的解決提供了保障?！?/p>
【關鍵詞】整體醫(yī)學；基因組；中醫(yī)心理學；中醫(yī)基因組學
1整體醫(yī)學
整體醫(yī)學是現(xiàn)代社會正在興起的一種醫(yī)學體系，將醫(yī)學看成一個有機整體，從整體上來認識醫(yī)學的性質、對象和目的。整體醫(yī)學與傳統(tǒng)中醫(yī)藥學在外表近似，但是本質有所不同。整體醫(yī)學從本質上說，是一種系統(tǒng)論。整體醫(yī)學就是用整體觀認識醫(yī)學的各個要素。而整體醫(yī)學的整體觀是建立在現(xiàn)代科學技術所認識的所有聯(lián)系的基礎上，從科學的長遠發(fā)展上來說，這是一種弱整體觀，一種綜合論，理論基礎是還原科學觀。
醫(yī)學的發(fā)展大致經(jīng)歷了三個時代，即經(jīng)驗醫(yī)學時代、實驗醫(yī)學時代和當前的整體醫(yī)學時代。經(jīng)驗醫(yī)學時代為自然哲學醫(yī)學模式，實驗醫(yī)學時代為生物醫(yī)學模式，而整體醫(yī)學時代為生物-心理-社會醫(yī)學模式。當今醫(yī)學的特點是處在實驗醫(yī)學時代向整體醫(yī)學時代的過渡時期，整體醫(yī)學的理論體系尚未正式形成，但已具雛形?，F(xiàn)代的整體醫(yī)學是現(xiàn)代科學技術尤其是生命科學發(fā)展的結果，但是生命科學——基因組學正在走向完善的基因組聯(lián)系，將來的發(fā)展必然在基因組的普遍聯(lián)系上證明中醫(yī)的基本理論，所以隨著基因組學的整體化發(fā)展，以及中醫(yī)學的跨越式發(fā)展，現(xiàn)代整體醫(yī)學必然走向更完備的、以中醫(yī)學為核心的整體醫(yī)學。
2中醫(yī)學現(xiàn)代化
整體醫(yī)學的崛起給中醫(yī)藥學國際化帶來了機遇，整體醫(yī)學與中醫(yī)藥學的關系是十分密切的。從理論體系看，整體醫(yī)學的理論與中醫(yī)藥學的學說實際上是相通的。如《黃帝內經(jīng)》中就提出“人與天地相參”的觀點。
中醫(yī)藥學其實就是一門完整的整體醫(yī)學。中醫(yī)學有著對人體自身整體性及人與自然、社會環(huán)境相統(tǒng)一的認識。但是中醫(yī)學又是一門模糊的整體科學?！饵S帝內經(jīng)》建立于二千多年前，是古人觀察人體與自然所建立的整體醫(yī)學，其本質就是結構與功能相統(tǒng)一的整體觀，但是由于社會發(fā)展水平和極端落后的科學技術條件的限制，這個時候形成的整體只能是粗略與模糊的。隨著時代的發(fā)展，由于封建禮教的限制，加之受中國哲學觀重用輕體、重道輕器價值取向的影響，人們開始疏于人體具體的形態(tài)和結構，歧視人體解剖，對人體的細節(jié)和局部方面未做較深入的剖析研究，隨之《內經(jīng)》的結構功能統(tǒng)一的整體觀逐漸演變?yōu)閱渭兊墓δ苄缘恼w觀。由于缺乏了結構和形態(tài)的支持，不能得到有效的可見的物質證據(jù)來說明自己的科學性，本身也缺乏創(chuàng)新發(fā)展，所以隨著以結構為主的現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，中醫(yī)學屢次受到打擊和排斥。
中醫(yī)藥學的發(fā)展必須從《黃帝內經(jīng)》的整體思想開始做起，真正認識整體的本質，結合現(xiàn)達的科學技術尤其是分子生物學技術，發(fā)展新時代的完整的結構與功能統(tǒng)一的整體觀。所謂中醫(yī)現(xiàn)代化就是用現(xiàn)代語言和科學技術重新描述人與自然、人與社會平衡條件下的人整體的運動規(guī)律。
當代分子生物學在迅猛發(fā)展，借助電子計算機技術處理大量數(shù)據(jù)，基因組學得到了極大的發(fā)展。在足夠的時間內，基因組學很可能走向整體，最后可能在基因的相互聯(lián)系中發(fā)現(xiàn)了中醫(yī)的陰陽五行所存在的基因證據(jù)，這時候中醫(yī)就會被分子生物學所吸收，現(xiàn)代的整體醫(yī)學就可能吸收了中醫(yī)藥學的優(yōu)勢發(fā)展成為完善的結構與功能統(tǒng)一的整體醫(yī)學，中醫(yī)不再是中國的中醫(yī)了。這是好事，但是對于國家和民族，對于中醫(yī)學的發(fā)源地，我們將失去一次崛起的機會。
3整體的含義
中醫(yī)學是整體科學，西醫(yī)學是還原科學。中醫(yī)現(xiàn)代化首先必須是基礎理論的現(xiàn)代化，而基礎理論的現(xiàn)代化又以整體為前提，整體觀的現(xiàn)代化為首要。以前中醫(yī)現(xiàn)代化的失敗在于從傳統(tǒng)的功能整體觀方法論上而不是從整體的根本意義上看待現(xiàn)代化。而西醫(yī)也是從自身的方法論上看待中醫(yī)，所以在這種前提下根本的中西醫(yī)結合是不可能的。
整體是物質的結構與功能的統(tǒng)一，兩者互相依存、不能分離，結構是功能的基礎，功能是結構的展現(xiàn)。整體是局部的整體，局部是整體的局部。整體是物質形、氣、能的統(tǒng)一，是結構與功能的統(tǒng)一，是一種客觀實在。
任何個體都是由兩種以上的物質要素混化而成的。這一混化物可以呈質地均勻無別的氣態(tài)，也可以呈實體存在的實體態(tài)。前者固然是一體，后者，盡管它的實體組成部分可以形形，各部分的功能也可千差萬別，但該實體物的氣卻遍布全體、貫穿內外，使組元形成有機聯(lián)系的和諧整體。這里所說的整體，指形成氣的時空結構而言，它是維系氣獨立性、特殊性的根本，也可把整體理解為氣的結構模式。譬如，設某模式為特殊的比附，這種特定的形狀結構的性質是不受其所占位置的大小影響的。因而時空結構模式一旦形成，不僅可以使全部事物的各個部分都處在同一結構上，而且這一整體特以滲透到所屬各個局部中去，使在這一整體中的局部組元可以體現(xiàn)整體，這是與組元作為獨立存在物的根本區(qū)別：①整體的實在性。②整體的聯(lián)系性：任何整體都在和其他整體處在密切的聯(lián)系當中，聯(lián)系是這個整體存在的必然條件，沒有聯(lián)系便沒有這個整體存在的必然性了。③整體的層次性：任何整體都是大的整體的一個組成部分，而這個整體有包含了小的層次的整體，小的局部組成。④整體規(guī)律的類似性：一物生來有一身，一物自有一乾坤。每個整體都是從類似規(guī)律演化而來，從無極演化，有太極，從這太極演化陰陽，以至這一整體全部。⑤整體的進化性：宇宙從無極逐漸演化太極，以至現(xiàn)在的萬物，在發(fā)展至人這個宇宙最高級的生命個體，便是整體演化的最好的證明。
氣是中醫(yī)學的核心?，F(xiàn)代醫(yī)學是從有形的結構上研究，形是氣所聚，形散為氣，氣是形的場，形氣是統(tǒng)一的。氣是整體的體現(xiàn)。那么從形氣理論的兩種醫(yī)學也是可以統(tǒng)一的。
整體性是貫穿人體宏觀和微觀的根本。從宏觀逐漸微觀，每一層次都是結構和功能的統(tǒng)一，每一層次都服從統(tǒng)一的整體性，而整體性是每一層次運動聯(lián)系的根本。這個的整體規(guī)律就是中醫(yī)基礎理論，這個規(guī)律指導著每一層次的運動和相互作用。
4建立中醫(yī)基因組學
基因組是現(xiàn)代生物學還原到分子的體現(xiàn)，由此生命科學開始轉向整體科學?，F(xiàn)在的功能基因組學就是這一轉向的體現(xiàn)?；蚪M是整體科學與還原科學的交匯點。
基因組是人體的微觀信息調控中心，更體現(xiàn)了人體的整體性。它是人的精氣的凝聚態(tài)，含有生命的全部信息。宏觀人體整體和微觀的人體基因組整體性是統(tǒng)一的和同源的，基因組整體是由五臟功能模塊組成，這五臟又有亞細的模塊組成，這亞細的模塊又有更微小的基因模塊組成，各個大模塊亞細模塊之間存在協(xié)調的相互關系，這個關系就是微觀經(jīng)絡系統(tǒng)?；蚬δ苣K由相應的基因組成，基因組整體是結構和功能統(tǒng)一的整體。建立中醫(yī)特色的基因組學是為了完善中醫(yī)藥學理論，發(fā)展整體醫(yī)學。建立微觀基因組整體辨證論治，并沒有否定傳統(tǒng)意義上的辨證論治觀，而是將其發(fā)展一步，深入到基因組整體內部，將整體觀深入到基因組整體中，將宏觀整體辨證和微觀基因組整體辨證結合起來，建立了一個從外至里、從里至外的整體的辨證論治觀，建立宏觀和微觀統(tǒng)一的整體的辨證體系。這才是科學的完整的辨證論治觀。
建立中醫(yī)基因組學是為了在基因研究的基礎上，結合證候研究，證明中醫(yī)證候理論的正確性；進而在分子基礎上證明中醫(yī)臟腑經(jīng)絡理論的正確性，最后深入基因組研究，深入了解基因組所蘊含的生命本質以及生命的發(fā)展。
中醫(yī)基因組學的建立是中醫(yī)現(xiàn)代化走向未來的一個關鍵點，整體科學與還原科學都在這一尖端領域進行著研究，而中醫(yī)學進入這一領域，一可以完善自己的理論體系，解譯基因組所包含的全部生命信息，促進人類的健康事業(yè)；二則可以引導還原科學的整體化演變。
5中醫(yī)心理學的發(fā)展
這是中醫(yī)心理學與現(xiàn)代心理學結合的關鍵點。也是中醫(yī)現(xiàn)代化的另一個關鍵點。
中醫(yī)心理學原來是中醫(yī)學的一個分支，以心理的整體功能為本體論述人的心理的，講的是人的先天功能。傳統(tǒng)中醫(yī)學建立在遠古極端落后的社會經(jīng)濟條件下，人們看不出人的社會本質和社會發(fā)展，而現(xiàn)代社會條件下，人的心理與健康都受到了社會的極大影響，發(fā)生了很大改變，中醫(yī)心理學也必須隨時代的發(fā)展而發(fā)展。
現(xiàn)代心理學是以人的大腦的具體結構為生理基礎，論述人在社會中的各種行為性格等，這是人的后天功能，對人們的各種行為意識均有科學的描述。但是現(xiàn)代心理學沒有與人的整體功能結合在一起，沒有指出人的根本的社會本質，所以其發(fā)展也是有局限的?，F(xiàn)代心理學是建立在還原論基礎上的，而人的心理是整體的，所以它本身具有很大的缺陷。
人的各種語言、行為以及意識思維等都是在人的元神的支配下進行的，元神是最根本的自我。而心理的進行是在社會背景條件下的，一切心理行為都有社會背景的，社會背景形成了人的心理模塊、人格模式，人格模式下的元神系統(tǒng)構成了人的社會自我，心理的行為是在元神的支配下通過心理模塊進行的，以此結合這兩個心理學，可以從根本上解決人的心理問題。佛學對人的心性理論有深刻認識，但是借鑒之前必須徹底拋棄佛學所具有的唯心思想，心性理論中性與元神相關，而心與元神、元神支配下形成的人格模式有關。
元神可以接受信息，加工、儲存、提取信息，發(fā)放信息三個方面。人出生時意識是白凈的，但是在人從出生開始，人就在不斷接受信息，在一定社會文化背景下不斷學習，不斷加深信息，積累信息，使元神中的信息不斷強化與激活而得到強化，最終形成了比較固定的人格參照模式。這個模式一旦形成，就形成了新進入信息的文化背景，形成了人各種意識、行為的模板，形成了特定的性格模式。人的性格模式是在元神支配下形成的，但是性格模式一旦形成就對人的元神人的生理發(fā)生作用，形成了人的后天行為的文化背景和模式。人的性格模式與人的后天社會文化環(huán)境有很大關系，它也不是固定不變的。
中醫(yī)心理學和現(xiàn)代心理學是功能與應用的結合。元神是人的整體功能，人的五臟情志、七情等都是人的元神功能的一個方面，但是這些情志的發(fā)生必然受到人的性格模式的影響，性格模式又決定了情志的發(fā)生模式。中醫(yī)心理學和現(xiàn)代心理學都是不完整的，各講述了人心理的一個方面，結合起來才是真正的人的心理整體過程。
人的心理在當今社會是一個比較陌生的領域，佛學、現(xiàn)代心理學、中醫(yī)心理學都有各自的認識，但是它們又不是完全的，正確的認識是將它們結合起來，建立科學的辨證唯物主義的整體的心理學體系。現(xiàn)代中醫(yī)心理學的建立不但解決了人的意識的根本問題，促進人類的心理健康發(fā)展，而是還對社會的發(fā)展有很大的潛在的作用。
6結論
關鍵詞：足球運動；心理變化因素；心理訓練
一、影響中學生足球運動員心理變化的因素
1.競賽規(guī)模和運動員面臨的任務。規(guī)模越大，比賽任務越重，運動員心理情緒就易于激動，易產(chǎn)生高度的情感，即榮譽感、社會責任感。如一支學校足球隊的運動員在參加校際間比賽時，因為競爭對手較弱，那么他們的情緒就不興奮，也就不容易發(fā)揮出最佳技戰(zhàn)術水平，當參加省、區(qū)級的比賽時，競爭對手的實力也很強，要想在比賽中取勝就不是很容易的事。而比賽任務很重，必須全力以赴，在為球隊爭光的情緒感染下，注意力高度集中，興奮性增強，能取得較好的成績。
2.參加比賽的隊伍水平實力對比。實力接近，情緒易于高漲，其實力懸殊較大，情緒就較低落，比賽都渴望勝利，但同樣也希望能遇上勢均力敵的對手。如2012年我?guī)呤械诙袑W足球隊參加湖北省青少年足球比賽，那是一場高水平的比賽，對手都是全省各地市的高手，全隊上下必須努力拚搏才能取得一場一場的勝利，在比賽中為了戰(zhàn)勝對手，但更是為了戰(zhàn)勝自己，向對手挑戰(zhàn)的同時也是對自我的一種挑戰(zhàn)。只有在強隊面前獲得勝利才是最后的勝利，要想戰(zhàn)勝對方，首先要戰(zhàn)勝自我。
3.訓練水平和比賽經(jīng)驗。經(jīng)驗豐富，準備充分，球隊整體訓練水平較高易產(chǎn)生增力情緒，反之，則產(chǎn)生減力情緒。初次參加比賽時不能很好的發(fā)揮出自己的水平，取得成績也不理想，是因為賽場環(huán)境在一定程度上會導至心情緊強和動作僵硬，反應和注意力降低，不能發(fā)揮出自己平時訓練的一般水平，可能比平時還要低落，這主要是情緒在作怪，我們平時的訓練要多從實戰(zhàn)出發(fā)，在每節(jié)訓練課中有針對性的培養(yǎng)，有目地性的強化，就可能避免臨場緊張的現(xiàn)象發(fā)生，通過練習比賽和友誼賽來增強他們的自信心。
4.參加比賽的動機。從運動員產(chǎn)生的動機是否與體育活動的目標、內容、方法相聯(lián)系來劃分，可分為內在和外在動機。內在動機包括：能勝任的動機，成就動機，以及接受挑戰(zhàn)的動機等；外在動機包括：教練員、家庭、社會等外部的壓力引起的運動動機，為了獲得物質上的報酬，高考得到加分。一般來說，內在動機能促進人們對體育目標的追求，其動力更足，持續(xù)作用時間更長。而運動員在從事體育活動時既有內在動機也有外在動機，兩者必須有機的結合，主次分明，才能調動運動員在訓練和比賽中的積極性。所以運動員有良好的動機，即使遇到困難，也能克服消極情緒，引起良性的興奮和振奮的精神狀態(tài)，并充分調動自身的力量戰(zhàn)勝困難，奪取比賽的勝利。
5.外界環(huán)境的干擾。比賽的勝利與失敗，不僅僅受運動員自身條件制約，同時還受外界環(huán)境的干擾，如天氣、場地、觀眾和裁判員等。這些外界環(huán)境的干擾，不同程度上的影響到運動員的心里活動。例如在雨天進行足球賽，觀眾少，場地泥濘等，往往使比賽氣氛冷淡，運動員不易調動積極性。反之，如果有熱情的觀眾助威、加油，比賽氣氛活躍，運動員就易產(chǎn)生奮發(fā)的情緒增強自信心，最終取得比賽的勝利。
二、中學生足球運動員的心理訓練方法
心理訓練是運動訓練重要內容之一，它分為一般心理訓練和賽前心理訓練。心理訓練對培養(yǎng)運動員在訓練和比賽中具有穩(wěn)定的、適宜的心理狀態(tài)促進訓練質量的提高以及在比賽中發(fā)揮出較好的運動水平，創(chuàng)造優(yōu)異成績都有重要意義。
1.自我暗示訓練。自我暗示訓練是運動員用自己的思想、詞語對自我的心理施加影響，以調整自己的情緒、意志和注意力等心理活動，從而提高自我的控制能力，在比賽中建立良好的狀態(tài)。如在運動員上場前反復提示隊員不要計較比賽的結果，排除一切干擾，全身心的投入到比賽中去，認真完成每一個技術動作，處理好每一個球，把個人的行為融入全隊的整體配合中去。
2.放松訓練。放松訓練是運動員通過自我的暗示來實現(xiàn)的，暗示是通過語言來進行心理調節(jié)的一種方法，它使疲勞的機體得到迅速和充分的休息，使情緒得到迅速的調整，信心百倍地準備下一場比賽。用語言提示進行心理和身體的暗示放松。放松暗示的語言有1.我安靜下來了；2.我的全身、大腦都放松了；3.我的呼吸很平穩(wěn)很輕松；進行戰(zhàn)前動員的暗示語言有：1.我休息過了，現(xiàn)在準備投入比賽；2.我積蓄了力量要為全隊出一把力；3.我頭腦很清醒，教練布置我的任務我定能完成；4.我感覺很好；5.看我的等等。
3.集中注意力訓練。集中注意力訓練是一種主要的注意力調節(jié)方法。集中注意力是指：人的身心傾向于某個目標，不分心 ，不受各種內外界因素干擾。實際上注意力的調節(jié)能力是運動員的一種重要的心理品質，這種能力既與先天的神經(jīng)系統(tǒng)的特征有關，又與后天進行系統(tǒng)的有意識的訓練和培養(yǎng)有關。具體的方法：1.教練員有意識的安排運動員在外界環(huán)境干擾下進行訓練和培養(yǎng)，如在比分讓幾球；在臨場裁判上制造錯判和偏護對方的判法，在心理承受力給予有意識的培養(yǎng)，通過意志品質的鍛煉，使隊員心理上有所準備。2.通過運動員的意志品質的隨時分配和轉移注意力的訓練。教練員安排計劃后，有意識地在同一訓練課中變換訓練內容，要求運動員迅速從一種方法、手段上轉移到另一種訓練方法、手段上，這樣可以提高運動員調節(jié)注意力的能力；3.在平時的訓練和學習中，教練員有意識地培養(yǎng)運動員養(yǎng)成無論做什么事都要專心致志，聚精會神的習慣，以提高運動員集中注意力的能力。4.在競賽環(huán)境的活動中，培養(yǎng)意志品質及整體觀念和個性發(fā)展。
關鍵詞： 功能基因組； 西瓜； 甜瓜； 黃瓜
功能基因組學（functional genomics），又被稱為后基因組學（post-genomics），它是利用結構基因組學提供的豐富信息和產(chǎn)物，借助高通量、大規(guī)模的試驗分析方法，在全基因組或系統(tǒng)水平上研究基因的功能，弄清生物體中各組分是如何工作并形成有功能的細胞、組織及整個生物體[1]。其目標是明確基因組中全部基因的功能， 揭示植物生長發(fā)育、環(huán)境應答互作的分子網(wǎng)絡， 從而全面闡釋植物的生物學基礎。目前，水稻、擬南芥等模式植物功能基因組學研究發(fā)展較快，近幾年隨著科技進步和資金投入的不斷增加，葫蘆科作物基因組研究也取得了一定的成果。西瓜基因組全長約425 Mb，甜瓜約450 Mb，黃瓜約376 Mb[2]， 基因組大小比較適合開展基因組測序和功能基因組研究。2007年由西班牙牽頭組織，美國、中國、法國、以色列、日本等國家的14個實驗室聯(lián)合啟動了國際葫蘆科基因組計劃（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），該計劃為瓜類蔬菜的基因組學研究奠定了良好的技術平臺。在此基礎上，2008年相繼啟動了葫蘆科三大作物西瓜、甜瓜、黃瓜的全基因組測序計劃[3]。隨著基因組測序工作的陸續(xù)完成，瓜類作物基因組研究逐步進入到功能基因組研究時代。本文綜述了近些年植物功能基因組學主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黃瓜上的應用概況。
1 高通量、大規(guī)模EST測序及功能解析
EST（Express Sequence Tag）是指通過對cDNA 文庫中隨機挑取的克隆進行大規(guī)模測序所獲得的cDNA 的5’或3’端序列，長度一般為150～500 bp。EST是基因編碼序列的一部分，通過與數(shù)據(jù)庫中已知功能的基因序列進行對比，從理論上可推測其基因功能。EST已發(fā)展成為新基因發(fā)現(xiàn)的有效途徑，也是植物功能基因組學研究的重要工具。隨著測序技術的不斷改良和測序成本的降低，高通量、大規(guī)模EST測序及功能解析開始廣泛應用。
西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構建了西瓜果實發(fā)育不同時期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫，獲得了832條無冗余EST，序列比對分析表明有410個EST-unigenes與已知編碼蛋白的基因同源，按功能歸類分屬于初級代謝、氨基酸合成組裝、細胞膜運輸、細胞分裂、細胞壁代謝、細胞骨架和細胞形成、基因轉錄和表達、信號轉導、抗性防御和次級代謝。這些潛在的功能基因序列為日后開展西瓜果實發(fā)育和品質形成的遺傳與功能基因組研究奠定了基礎。呂桂云等[5]通過構建枯萎病菌誘導的西瓜根系組織SSH-cDNA文庫，對測序獲得的4 431條高質量EST序列進行聚類拼接，獲得1 756個非重復序列，基因功能分類表明抗病與防御相關基因約占36.3%，對獲得的西瓜與枯萎病非親和互作中部分特異性表達的基因進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)可能參與西瓜與枯萎病菌非親和互作的轉錄因子、激酶和防衛(wèi)基因及茉莉酸和木質素2個主要代謝途徑。Guo等[6]采用Roche/454新一代測序技術，從西瓜4個果實發(fā)育期（授粉后10、18、26、34 d）獲得了577 023個高質量EST，組裝成了75 068個unigenes，有54.9% 的unigenes與GeneBank中的已知基因同源，其中2/3來源于黃瓜。Gene Ontology （GO）注釋表明，有33 853個unigenes（45.1%）獲得至少1個GO術語，被注釋序列的基因功能分屬于分子功能（molecular function）類別、生物過程（biological process）類別和細胞組分（cellular component）類別，所占比例分別為38.6%、38.6%和36%，另外大約29%的unigenes同時具有以上3種功能分類。生物過程類別的基因主要參與細胞過程、代謝過程和生物合成過程，表明果肉組織在發(fā)育過程中發(fā)生了廣泛的代謝活動。數(shù)字基因表達譜分析及實時定量PCR驗證表明有3 023個基因在果實發(fā)育不同時期存在顯著的表達差異，表達量差異至少在2倍以上。研究發(fā)現(xiàn)細胞壁相關基因在未成熟白瓤果肉組織中高效表達，而類葫蘆卜素代謝基因（八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素-β環(huán)化酶）、蔗糖代謝基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果實發(fā)育不同時期差異表達明顯，作者對與果實品質相關的一些生化途徑如纖維素合成、木栓質合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等進行了進一步鑒定。
甜瓜大規(guī)模EST測序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通過構建甜瓜EST數(shù)據(jù)庫，從4 800條序列中鑒定出與甜瓜果實香味代謝相關的3類基因家族，乙醇乙酰轉移酶、倍半萜合酶和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，克隆得到候選基因的全長序列，研究了這些基因在不同甜瓜品種間的表達模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通過對8個來源于甜瓜不同組織和生理狀態(tài)的cDNA文庫（包括授粉后15 d和46 d的2個果實的文庫）測序和序列拼接、組裝，獲得16 637個無冗余EST。通過與擬南芥基因組做生物信息學比對分析，發(fā)現(xiàn)眾多個與果實發(fā)育相關的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、細胞壁代謝酶、類胡蘿卜素合成代謝酶、MADS-box 基因等。實時定量PCR表明在果實成熟期乙烯受體基因EIN4表達量翻倍，表明該基因與果實成熟期乙烯信號調控相關。MADS-box 基因SVP在果實成熟期表達量下降了4倍，番茄紅素ε環(huán)化酶基因（LUT2）和木葡聚糖內糖基轉移酶基因（TCH4）表達量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]構建了4個不同類型甜瓜品種不同植物組織的11個全長cDNA文庫和4個標準化cDNA文庫，分別獲得71 577 條和22 179條EST，能夠組裝成24 444條unigenes，基因對比顯示有75%～85%的序列與雙子葉植物同源，70%與單子葉植物同源，有6 972個基因家族在雙子葉植物和單子葉植物間具有保守性。對數(shù)字基因表達譜研究，結果表明有175個基因為組織特異表達，這些基因為未來開展功能基因組研究提供了寶貴的資源。作者從這些序列中鑒定出了4 068個SSR和3 073個SNP，并對1 382個全長轉錄組進行了分析。為了解甜瓜對鹽脅迫的抗性反應機制，Shiwei Wei等[10]構建了耐鹽甜瓜品種根系組織的抑制消減雜交（SSH）cDNA文庫，測序獲得262條uni-ESTs，有161條序列與已知基因高度同源，128條與未知功能基因同源，有很多基因顯示與生物和非生物脅迫相關。研究表明，甜瓜耐鹽受眾多蛋白質調控，這些蛋白涉及細胞代謝、能量、轉錄、信號轉導、蛋白質命運以及細胞拯救和防御等生物過程，表明甜瓜作物耐鹽存在復雜的抗性反應機制。
在黃瓜上面，Dae-Jae Kim[11]構建了黃瓜子葉生長不同時期的cDNA文庫，篩選出大量與衰老相關的基因，利用半定量RT-PCR分析了365個克隆，發(fā)現(xiàn)有很多基因表達量提高，這些基因有些功能已知，有些功能未知。齊曉花等[12]采用SMART 技術構建了高抗白粉病的黃瓜品系JIN5-508 的葉片cDNA文庫，利用該文庫隨機挑選的8 352個克隆從5’端進行單向測序，共獲得8 035個有效的ESTs，序列的平均長度為838 bp。從文庫中篩選出了大量的低豐度表達基因，約占unigene總數(shù)的72.5%，1 991個unigenes 獲得分子功能注釋，其中與蛋白結合活性和催化活性相關的基因分別達到了41.34%和38.72%；在獲得功能注釋的unigene 中，有部分抗病抗逆相關基因高豐度表達，其中3個unigenes與擬南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消減雜交技術（SSH）構建黃瓜胚胎發(fā)育早期和晚期差異表達cDNA文庫，經(jīng)反向Northern blot雜交檢測，共得到97個陽性克隆。利用分子生物學軟件對測序后的序列進行質量檢測和聚類、拼接，共得到93個Uni-ESTs，其中包括86個singletons 和7個contigs。將上述EST序列在GenBank上進行BLAST比對，有83個EST片段找到了與之匹配的同源序列，有10 個EST片段未找到同源序列，推測可能是新基因。其中很多EST與擬南芥、水稻或玉米蛋白質數(shù)據(jù)庫中的熱激蛋白具有很高的同源性。將以上序列進行功能分類，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期細胞防御和代謝過程占主要位置，而在胚胎發(fā)育晚期細胞防御和抗?jié)B透脅迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黃瓜全雌系和雌雄同株系測序獲得353 941條EST，其中188 255條來源于全雌花，165 686條來源于雌雄花，結合5 600條GeneBank收錄的EST和mRNA序列，組裝成了81 401條unigenes。通過基因功能注釋和分析，預測了343個生化代謝途徑。對數(shù)字基因表達分析，表明大約200個基因在不同花性型存在差異表達，為研究植物花分化的分子機理提供了新的認識。潘宇等[15]構建了黃瓜授粉前后多個發(fā)育階段的幼果組織cDNA文庫，測序獲得116條EST，92.2% 的長度在400 bp以上，19% 為重疊序列。在GeneBank中進行BLAST分析后確認與已知功能基因相似的EST序列有71條，有相似序列而功能未知的基因和沒有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。
2 TILLING技術
TILLING（targeting induced local lesions in
genomes，定向誘導基因組局部突變技術），該技術借助高通量、標準化的檢測手段，快速有效地從經(jīng)化學誘變劑（EMS）誘變過的突變群體中鑒定出點突變。與傳統(tǒng)的插入突變比，TILLING技術利用傳統(tǒng)的化學誘變獲得突變體，不需要耗時的轉基因和復雜的組織培養(yǎng)過程，具有高通量、低成本、高效率等諸多優(yōu)勢。目前，TILLING作為一種全新的反向遺傳學研究方法已經(jīng)用于多種植物。
TILLING技術在葫蘆科作物上的應用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS誘變構建了甜瓜品種Noy Yizreel的突變基因庫，共產(chǎn)生3 000個M2家系，發(fā)現(xiàn)了大量新的表型突變，大部分為隱性單基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品種Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技術平臺，CharMono系雌雄同株、呼吸躍變型，在M2現(xiàn)了大量子葉、莖蔓、花和果實發(fā)生的表型突變，利用與果實品質相關的11個基因篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)大約每隔573 kb會發(fā)生一個突變，大部分都是G/C 突變成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的變異，外顯子測序表明31.3%為基因沉默突變，65.1%為錯義，2.4%為轉錄終止，1.2%為拼接剪接突變，氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1篩選到7個獨立的點突變，其中G194D果皮顏色變異明顯，果實延遲成熟黃化，而果形、可溶性固形物含量和果肉顏色仍然與野生型一樣。G194D自交純合株系也呈現(xiàn)出果實發(fā)育期延長、果肉變硬和果實延熟，并且在2個不同試驗地點表現(xiàn)一致，這些表型變異證明了G194D系CmACO1基因突變而來，該研究利用TILLING技術成功創(chuàng)造了甜瓜品質新資源，顯著提高了品種貨架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品種Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技術平臺，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸躍變型，EMS誘變得到2 368個M2家系，用病毒侵染抗性相關的2個基因Cm-eIF4E（核細胞翻譯起始因子）、eIF（iso）4E（核細胞翻譯起始因子異構體）、4個與果實成熟相關的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脫氧羧腐胺賴氨酸合酶）以及PDS（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)有4個Cm-eIF4E等位基因突變，推測其中的2個改變了蛋白質功能，PDS有2個等位突變，發(fā)生在外顯子的突變改變了蛋白質功能，造成了苗期白化表型突變。4個與果實成熟相關的基因在群體中篩選突變，得到8個突變的家系。徐美紅等[19]用PCR產(chǎn)物直接測序和克隆測序2種方法用于檢測這8個突變家系的堿基變化。在直接測序中，4個突變家系的測序結果清晰，能夠確認堿基的變化；其他4個家系的結果不清晰，不能確認堿基的改變。在克隆測序中，8個家系的測序結果均清晰，能夠直接確定目的基因的點突變。在2種方法的比較中，克隆測序的準確率、效率明顯優(yōu)于直接測序法。
黃瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通過EMS誘變獲得了大約1 000個M2家系，在苗期發(fā)現(xiàn)了諸如植株矮化、子葉自發(fā)病變、黃（花）葉、白化苗、葉片卷曲、窄型黑色子葉等諸多表型突變，利用PDS-3（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)了4個突變家系，測序表明堿基突變均發(fā)生于基因內含子區(qū)域，因此并未造成相應的黃化表型突變。該套突變體庫為黃瓜反向遺傳學及基因功能研究奠定了很好的基礎。
西瓜作物TILLING技術的應用尚未見正式報道，美國農(nóng)業(yè)部蔬菜研究實驗室的科學家目前正在從事相關的工作，預計將很快取得進展。
3 DNA芯片
DNA芯片是利用已知基因組序列，或來自未知序列的 cDNA 克隆制備模板 cDNA，通過人工或特定的儀器將大量模板 cDNA 按設計好的順序定量地固定在載體上制備成高密度的微陣列。將標記好的樣品 cDNA 片段（來自不同細胞、組織或整個器官）與模板上的cDNA 進行分子雜交。根據(jù)不同材料間基因差異表達的信息，推論某個基因的功能或鑒定和分離目的基因。DNA 芯片還廣泛應用于基因表達譜、突變基因篩選和轉基因鑒別等方面。
在西瓜上，Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構建了西瓜果實發(fā)育不同時期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫。為進一步探究這些EST-unigenes在果實發(fā)育不同時期的轉錄表達差異，W. Patrick Wechter等[21]利用微列陣（microarray）技術對這些EST進行了差異表達分析，發(fā)現(xiàn)與葉片相比，有335個ESTs的表達存在明顯的差異，表達量差異至少在2倍以上。其中有211個與已知功能基因同源，96個為未知基因。這些基因參與了維管系統(tǒng)、類胡蘿卜素合成、轉錄調控、病原和逆境脅迫響應以及乙烯合成等，實時定量PCR也驗證了這些功能基因的差異表達。
在甜瓜上，張紅等[22]利用國內首個甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0檢測了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果實基因表達以及經(jīng)60Co射線輻射誘變后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病變異株成熟果實基因的表達。結果顯示，該芯片平均能夠檢測新疆厚皮甜瓜基因2 008個，檢測出的基因占該芯片基因探針總數(shù)的65.4%。發(fā)現(xiàn)酸味抗病變異株上調表達的基因有251個，占檢出基因總數(shù)的12.5%，下調表達的基因224個，占檢出基因總數(shù)的11.16%。RT-PCR重復試驗表明用Melon cDNA array ver 1.0檢測新疆厚皮甜瓜成熟果實基因表達水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花葉病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片檢測了17 443個unigenes的表達，發(fā)現(xiàn)接種感染后TGR-1551比對照發(fā)生了顯著的轉錄差異，與空白對照相比，Tendral有 3 291個unigenes 差異表達，TGR-1551有2 488個unigenes 差異表達，共有677個unigene unigenes受到抑制表達。說明TGR-1551發(fā)生了廣泛、深刻的轉錄差異。
在黃瓜上，毛偉華等[24]通過GenBank搜索已的生物代謝途徑中的關鍵酶基因序列， 設計特異性引物， 采用RT-PCR法擴增這些酶的相應基因片段，在完成432個基因片段的克隆分離、測序和生物信息學分析工作的基礎上研制出國內首張黃瓜cDNA 芯片。該芯片含有9個質控cDN段和423個cDNA探針， 涉及光反應、卡爾文循環(huán)、碳水化合物代謝、水-水循環(huán)、信號傳導、激素代謝、光呼吸、防御、蛋白與氨基酸代謝等多個代謝途徑。利用該芯片對黃瓜缺鎂脅迫下基因表達譜進行了初步研究， 發(fā)現(xiàn)在缺鎂脅迫下差異表達的22個基因， 其中10個基因的表達受缺鎂處理抑制， 12個基因的表達受缺鎂處理誘導。該芯片的研制為進一步研究黃瓜功能基因的高通量時空變化提供了有效的技術支撐。為驗證該套cDNA芯片雜交結果的可靠性，毛偉華等[25]研究了黃瓜在CMV 侵染脅迫下的基因表達譜變化，并對其中5個具有代表性的基因通過實時熒光定量PCR（QRT—PCR）進行檢測，共獲得67個差異表達顯著的基因，其中42個基因下調表達，25個基因上調表達。這些差異表達的基因涉及了許多重要代謝途徑，許多與光合作用、氮同化相關的基因受到明顯的抑制，而一些防御相關基因和信號傳導相關基因則誘導表達。同時，也發(fā)現(xiàn)了一些與CMV 脅迫相關的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究發(fā)現(xiàn)，CMV 脅迫引發(fā)了黃瓜代謝發(fā)生一系列復雜的適應性變化，PR1-1a 等基因可能在黃瓜防御CMV侵染過程發(fā)揮著重要作用。
4 RNAi技術
RNAi（RNA interference）是一種雙鏈RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技術具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，根據(jù)表型變異可推測該基因的功能，RNAi已發(fā)展成為功能基因組學研究中基因功能鑒定的一種強有力的工具。
2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技術沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核細胞翻譯起始因子）基因，通過對轉基因T2代接種8種甜瓜易侵染的病毒，發(fā)現(xiàn)轉基因植株對黃瓜葉脈黃化病毒（CVYV）、甜瓜壞死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花葉病毒（MWMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）產(chǎn)生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜對這4種病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因對于甜瓜作物廣譜高抗等位基因的發(fā)現(xiàn)，將是一個有效的選擇途徑。程鴻等[27]通過RT-PCR 方法從甜瓜中克隆得到白粉病感病相關基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 結果表明，CmMLO2 主要在甜瓜葉片中表達，具有組織特異性。在受到白粉病菌脅迫時CmMLO2表達顯著上調，表明CmMLO2 很有可能與白粉病發(fā)病有關。構建RNAi表達載體，利用葉盤轉化法轉化甜瓜，獲得了PCR 陽性植株，對白粉病接種鑒定結果表明，轉化植株對白粉病具有抗性，證明通過ihpRNAi敲除CmMLO2，可以獲得對白粉病具有抗性的甜瓜材料。
5 T-DNA插入突變
T-DNA（transferred DNA）是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）內 Ti 質粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并穩(wěn)定地整合到植物基因組中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因組中的T-DNA 類似于給基因貼了一個序列標簽。通過分離T-DNA 標簽位點的側翼水稻基因組序列， 可以快捷地找到含有標簽的基因， 經(jīng)過插入標簽基因與突變體表型的共分離檢測， 從而獲得基因的生物學功能。任海英等[28]采用農(nóng)桿菌侵染子葉外植體的方法產(chǎn)生T-DNA 插入的甜瓜突變體，篩選到一個蔓枯病抗性明顯增強的突變體，命名為edr2，該突變體是T-DNA 單拷貝插入甜瓜染色體引起的，edr2 的蔓枯病抗性和標記基因卡那霉素抗性基因共分離。蔓枯病菌在突變體甜瓜edr2上的侵染過程與在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌發(fā)率降低、芽管的伸長和菌絲的生長較遲緩。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突變體發(fā)生細胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的細胞發(fā)生程序性死亡。本研究為選育抗蔓枯病的甜瓜品種提供了新的思路，為挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。
6 展 望
西瓜[29]、甜瓜[30]、黃瓜 [31]全基因組測序已完成并對外公布，測序獲得的大量生物信息為開展功能基因組學研究奠定了基礎，也標志著瓜類作物基因組研究逐步進入到功能基因組研究時代?？梢灶A測，未來將會有更多不同類型的cDNA文庫，包括全長cDNA文庫被構建，更多的EST序列將被釋放，從而為基因芯片的開發(fā)提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突變體庫的構建工作也將陸續(xù)啟動或完成，更多的功能基因將被鑒定和分離。功能基因組研究的深入有望鑒定和分離出控制重要農(nóng)藝性狀的全部基因， 揭示基因的時空表達模式，弄清在性狀形成中基因與基因的互作，并在此基礎上形成對基因調控網(wǎng)絡的認識。屆時人們就能夠從基因結構和基因表達調控兩個方面對基因進行修飾，在作物育種實踐中實現(xiàn)分子設計育種，從而培育出抗逆性強、品質優(yōu)良、有益人體健康的西瓜、甜瓜、黃瓜品種，滿足人們不斷增長的消費需求。
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