發(fā)布時間：2023-09-21 16:53:13
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的醫(yī)學(xué)影像和醫(yī)學(xué)影像技術(shù)樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
【摘要】 為彌補解剖結(jié)構(gòu)圖像（CT， MRI， B超等）和功能圖像（SPECT， PET等）的各自不足，醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)應(yīng)運而生，并且有了較大發(fā)展. 本文從三方面綜述了近年來有關(guān)醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)研究的最新進展，認為在醫(yī)學(xué)影像設(shè)備的發(fā)展中，功能圖像和解剖圖像的結(jié)合是一個發(fā)展趨勢，在腫瘤的精確定位、早期檢測和診斷中將發(fā)揮重要的作用.
【關(guān)鍵詞】 診斷顯像；圖像融合
0引言
醫(yī)學(xué)影像學(xué)是臨床診斷信息的重要來源之一. 根據(jù)醫(yī)學(xué)圖像所提供的信息內(nèi)涵，可將醫(yī)學(xué)影像分為兩大類： 解剖結(jié)構(gòu)圖像（CT， MRI， B超等）和功能圖像（SPECT， PET等）. 這兩類圖像各有其優(yōu)缺點： 功能圖像分辨率較差，但它提供的臟器功能代謝信息是解剖圖像所不能替代的；解剖圖像以高分辨率提供了臟器的解剖形態(tài)信息（功能圖像無法提供臟器或病灶的解剖細節(jié)），但無法反映臟器的功能情況.
目前這兩類成像設(shè)備的研究都已取得了很大的進步，一方面，雙方都在逐步彌補自身弱點，如MR的功能成像開發(fā)以拓展其功能，SPECT， PET新型晶體開發(fā)以增強自身的空間分辨率；另一方面，雙方均在不斷地增強自身強項，如MR開發(fā)不同新型成像序列，CT的螺旋層數(shù)不斷增加，PET的晶體數(shù)目越來越多. 這使得各自圖像的空間分辨率和圖像質(zhì)量有很大的提高，但由于成像原理不同所造成的圖像信息局限性，使得單獨使用某一類圖像的效果并不理想，且進展緩慢，往往事倍功半. 由于上述原因，醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)應(yīng)運而生［1］.
1圖像融合（image fusion）技術(shù)的內(nèi)涵
圖像融合是指將多源信道所采集到的關(guān)于同一目標的圖像經(jīng)過一定的圖像處理，提取各自信道的信息，最后綜合成同一圖像以供觀察或進一步處理［2］. 簡單來說，醫(yī)學(xué)圖像融合就是將解剖結(jié)構(gòu)成像與功能成像兩種醫(yī)學(xué)成像的優(yōu)點結(jié)合起來，為臨床提供更多、更準確的信息. 其最終結(jié)果是1＋1>2.
20世紀90年代以來，醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)隨著計算機技術(shù)、通訊技術(shù)、傳感器技術(shù)、材料技術(shù)等的飛速發(fā)展而獲得重大發(fā)展，經(jīng)歷了異機圖像融合和同機圖像融合兩個階段.
2異機圖像融合
2.1異機圖像融合的研究內(nèi)容在同機融合顯像設(shè)備沒有出現(xiàn)以前，圖像融合的研究僅限于異機圖像融合. 最初其研究內(nèi)容僅限于相同或不同成像模式（imaging modality）所得圖像經(jīng)過必要的幾何變換，空間分辨率統(tǒng)一和位置匹配后，進行疊加獲得互補信息，增加信息量. 而現(xiàn)在，異機圖像融合的研究范圍包括： 圖像對位、融合圖像的顯示和分析，利用從對應(yīng)解剖結(jié)構(gòu)圖像（MRI， CT）獲取的先驗信息對發(fā)射型數(shù)據(jù)（SPECT， PET）做有效的衰減校正、數(shù)據(jù)重建等［3］.
2.2異機圖像融合的基本方法按圖像融合對象的來源可分為同類圖像融合（innermodality，如SPECTSPECT， CTCT等等）和異類圖像融合（intermodality，如SPECTCT， PETMRI， MRICT， MRB超等). 按圖像融合的分析方法可分為同一患者的圖像融合、不同患者間的圖像融合和患者圖像與模板圖像融合. 按圖像融合對象的獲取時間可分為短期圖像融合(如跟蹤腫瘤的發(fā)展情況時在1~3 mo內(nèi)做的圖像進行融合)和長期圖像融合(如進行治療效果評估時進行的治療后2~3 a的圖像與治療后當(dāng)時的圖像進行融合). 臨床工作人員根據(jù)自己的研究目的不斷設(shè)計出更多的融合方式.
2.3異機圖像融合的主要技術(shù)圖像融合的步驟大致為： 特征提取，設(shè)計誤差評估方法，對圖像數(shù)據(jù)進行處理使誤差最小，將變換后的圖像數(shù)據(jù)進行對位和綜合顯示，分析綜合數(shù)據(jù). 其中對位技術(shù)是圖像融合的關(guān)鍵和難點［4］.
2.3.1特征提取特征提取可分為內(nèi)部特征提取和外部特征提取內(nèi)部特征主要是人體解剖結(jié)構(gòu)特征，如顱骨、脊柱、胸骨、肋骨、關(guān)節(jié)；膈下軟組織，如脾、肝、腎等等. 外部特征是為進行融合處理而特制在兩幅圖像上均可見的體表標記物. 據(jù)文獻報道使用的外標志物有進行腦圖像融合的頭罩、牙環(huán)，胸部、腹部圖像融合采用的背帶，四肢圖像融合采用的支架，甚至顱骨嵌入螺釘?shù)鹊? 采用內(nèi)部特征的優(yōu)點是不需要對患者做預(yù)處理，可進行多次融合方法分析，缺點是難以實現(xiàn)融合自動化處理，需要人工干預(yù)，融合的精確性往往與經(jīng)驗有關(guān). 外部特征的優(yōu)點是特征明確，易于進行計算機自動處理，缺點是預(yù)處理復(fù)雜，并且由于而引起的臟器與體表標記之間的位移誤差難以避免.
2.3.2誤差評估方法常用的有基于相似度的誤差評估方法(以相似度最大為最優(yōu))和基于距離的誤差評估方法(以距離最小為最優(yōu)).
2.3.3圖像處理圖像預(yù)處理： 對于有條件的圖像進行重新斷層分層(reslice)以確保圖像在空間分辨率和空間方位上的大體接近. 幾何變換： 主要包括尺度變換、平移、旋轉(zhuǎn)等.
2.3.4圖像的對位將處理好的圖像按誤差最小的原則進行對位. 按外部特征進行對位的方法以兩幅圖像上的特征點配準為對位成功. 按內(nèi)部特征進行圖像對位法主要有兩種：圖像分割配準和像素特征配準［5］.
圖像分割配準法分為曲線法和表面法，在目前實際應(yīng)用中較多采用. 因分割算法通常是半自動的，需人為參與，其配準的精度受限于分割的精度. 理論上此法可用于全身各部位的配準，但現(xiàn)在常用于神經(jīng)系統(tǒng)成像和矯形外科成像. 曲線法是將一些具有幾何特征的線條（如脊線）或柵格提取出來進行配準. 但是，曲線法要求圖像有較高分辨率，以便提取幾何特征. 表面法的代表算法是“頭帽法”： 從一幅圖中提取一組輪廓點作為“帽子”，從另一幅圖中提取表面模型作為“頭”，然后使用Powell搜索算法（使帽點和頭表面間的距離平均平方和最小）來確定變換關(guān)系. 采用表面匹配技術(shù)可以對SPECT和PET的心臟圖像進行了對位融合.
表面配準算法不僅用于3D剛性（rigid）變換，而且可用于3D彈性（elastic）變換，從而為一些組織器官的配準，如心臟、肝臟、肺等，提供了可能性. 但這種方法與其他基于組織分割的算法一樣，配準精度受限于組織分割的精度. 近年來，由于分割算法的復(fù)雜程度降低、自動化程度提高以及斜面匹配技術(shù)在計算距離變換上的優(yōu)勢，此法被普遍應(yīng)用. 表面配準法主要應(yīng)用于PETMR圖像的配準，由于SPECT圖像的邊界模糊，不宜使用此法. 像素特征配準法［6］： 像素特征配準法與其他內(nèi)部特征配準方法不同之處在于，他是以圖像灰度為配準依據(jù)，不需要對圖像原始數(shù)據(jù)進行預(yù)歸納或預(yù)分割，其常用算法有主軸矩配準、全圖像信息配準和圖譜法配準. 主軸矩配準： 是將圖像灰度內(nèi)容轉(zhuǎn)換為數(shù)量和方向的幾何表示. 目前大多是從零階及一階矩中計算出圖像的質(zhì)心及主軸，再通過平移和旋轉(zhuǎn)使兩幅圖像的質(zhì)心和主軸對齊，達到配準目的. 此法對于數(shù)據(jù)缺失比較敏感，細節(jié)丟失或形狀的病理性改變均會影響配準結(jié)果. 但此法實現(xiàn)了自動化，且十分快捷，易于移植，目前多用于粗配準. 全圖像信息配準： 是在配準全過程中使用全部圖像信息，使用的算法有區(qū)域相似性測量法、最大互信息法、相關(guān)法、聯(lián)合熵法、條件熵法等. 此方法適用性最廣，它不象其他內(nèi)部特征法那樣需先進行灰度圖像的信息壓縮提取，而是在配準過程中利用所有可獲得的信息. 圖譜法： 用于患者間的圖像配準同一解剖結(jié)構(gòu)的形狀、大小、位置都會因解剖和生理上的個體差異有很大不同，這就使患者間的圖像配準問題成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)圖像分析中的最大難題. 因此就要有一個詳細標記人體各個解剖位置的標準化圖譜. 用圖譜法對兩個患者的PET或MRI圖像進行比較時，首先把二者的圖像都映射到一個標準化的圖譜空間去，然后在此空間中進行比較. 使用內(nèi)部特征定位不需外加定位裝置，但要求兩幅圖像要有相似結(jié)構(gòu)或共同特征才可進行匹配. 定位的精確度是由具體的算法來決定的.
2.3.5融合數(shù)據(jù)的分析以某種算法將融合圖像數(shù)據(jù)綜合顯示并做定量分析. 有些影像學(xué)工作者提出了如融合圖像中像素CT值/SPECT計數(shù)等數(shù)值分析方法，但由于圖像融合技術(shù)研究時間較短，各種融合數(shù)據(jù)對臨床的指導(dǎo)意義有待進一步檢驗確定.
融合圖像有多種直觀的顯示方法. 常用的有斷層顯示法和三維顯示法. 融合圖像的顯示往往以某個圖像為基準，該圖像用灰度色階顯示，另一個圖像迭加在基準圖像上，用彩階顯示［7］： ① 斷層顯示法： 對于某些（得到原始數(shù)據(jù)）圖像融合，可以將融合的三維數(shù)據(jù)以橫斷面、冠狀面和矢狀面斷層圖像同步地顯示，便于觀察者進行診斷. 這是融合圖像最常用的顯示方法. 這種顯示要求觀察者對于圖像三維層面的特征有豐富的經(jīng)驗； ② 三維顯示法： 將融合的三維數(shù)據(jù)以三維圖像的形式顯示使觀察者可更加直觀地觀察病灶的解剖位置，在外科手術(shù)設(shè)計和放療計劃制定中有重要的意義.
2.4異機圖像融合的現(xiàn)狀目前對于剛性組織的對位已基本解決，如腦部異機圖像融合［8］，而對于非剛性組織（如腹部）的對位有待進一步研究. 因此在圖像對位技術(shù)上目前尚未找到一種確保完全、通用、有效的方法.
3同機圖像融合
同機圖像融合是伴隨著同機顯像設(shè)備的發(fā)展而發(fā)展的. 1991年，Hasegawa等［9，10］人首先提出了同機圖像融合設(shè)備的設(shè)想. 1999年，通用電器公司(GE)推出了全球第一臺醫(yī)用同機圖像融合設(shè)備Hawkeye，它將XCT球管、探測器及放射性核素探頭裝在同一旋轉(zhuǎn)機架上，患者可同時進行CT和SPECT檢查. 得到的X線圖像不僅可以用來與SPECT圖像進行融合，還可以通過不同軟組織及骨骼對X線與γ光子的不同衰減比例因子，由CT值計算線性衰減系數(shù)，進行SPECT的衰減校正. 由于這一臺劃時代設(shè)備的出現(xiàn)，使得圖像融合技術(shù)發(fā)生了根本性的變化.
由于圖像融合設(shè)備顯像過程中，患者同時進行兩種不同的檢查，其變化由計算機精確控制，且不同顯像間的時間間隔非常短暫，從根本上解決了異機圖像融合中的最大難題：對位技術(shù)的準確性. 在CT與SPECT圖像融合的領(lǐng)域內(nèi)，它具有了所有異機圖像融合的優(yōu)勢，而且實現(xiàn)過程更為簡單，并廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域［11］. 因此，這一設(shè)備從產(chǎn)生之日起，就對影像醫(yī)學(xué)特別是影像核醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響. 目前已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)、外影像醫(yī)學(xué)臨床診斷.
在Hawkeye之后，GE公司、西門子公司及飛利浦先后推出了第二代圖像融合設(shè)備： PET/CT［12］，其功能在Hawkeye基礎(chǔ)上更進一步，定位更加準確，診斷準確性進一步提高. 目前國內(nèi)有此設(shè)備十余臺.
相比PET/CT，PET/MR的研究更加令影像醫(yī)學(xué)工作者期待. PET/MR除具有所有PET/CT的優(yōu)點外，還可以提供更多的軟組織信息，其提供的組織信息可應(yīng)用于高精度的PET圖像衰減校正，從而進一步提高圖像質(zhì)量和空間分辨率. 目前，美國將PET晶體置于MR內(nèi)部，已研制出一種新型的PET/MR，并已獲得了大鼠腦部同機融合圖像［13］，相信PET/MR很快將進入臨床.
4展望
總之，在醫(yī)學(xué)影像設(shè)備的發(fā)展中，功能圖像和解剖圖像的結(jié)合是一個發(fā)展趨勢，而圖像融合的潛力在于綜合處理應(yīng)用這些成像設(shè)備所得信息以獲得新的有助于臨床診斷的信息［14］，在腫瘤的精確定位、癌癥的早期診斷和治療中發(fā)揮重要的作用. 隨著功能成像設(shè)備和解剖成像設(shè)備雜交技術(shù)的出現(xiàn)，圖像融合技術(shù)將得到進一步的發(fā)展，給臨床診斷帶來一場新的變革.
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[關(guān)鍵詞] 醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)；腫瘤；放射治療
[中圖分類號] R730 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）11（b）-0196-03
[Abstract] Objective To discuss the application effect of medical image fusion technology in cancer radiotherapy by takeing CT-MRI image fusion technology as an example. Methods 50 patients with prostate cancer admitted to this hospital from January 2013 and January 2014 were included. They all underwent CT and MRI scanning. We compared CT image and fusion image in determining the target volume and radiation dose. Results The tumor volume was 72.45cm3 on the CT image and 51.12cm3 on the CT-MRI fusion image， and the area of target tumour cells determined by the CT-MRI fusion image was precise than that determined by CT image. Calculation results of dose of radiation to the bladder and rectum showed that the minimum radiation dose and maximum radiation dose of the fusion image were both smaller than that of the CT image， and the difference was statistically significant，（P
[Key words] Medical image fusion technology； Tumor； Radiotherapy
醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)[1]作為當(dāng)代科技與醫(yī)學(xué)影像相結(jié)合的計算機信息融合工程，為臨床腫瘤診斷、治療提供多模態(tài)圖像，為醫(yī)學(xué)診斷提供了更確切的醫(yī)學(xué)信息。醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域在于腫瘤的放射治療，通過各種模態(tài)醫(yī)學(xué)圖像的融合，準確勾勒出腫瘤靶區(qū)輪廓，使腫瘤放射治療更加精準和有效[2]。該文將通過對該院2013年1月-2014年1月收治的50名前列腺癌癥患者，應(yīng)用CT―MRI融合技術(shù)確定前列腺癌強調(diào)放療靶區(qū)，綜合分析、探討醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)在腫瘤放射治療中的應(yīng)用效果，現(xiàn)報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
整群選取該院2013年1月-2014年1月收治的前列腺癌癥患者50名為研究對象。病例年齡5678歲，平均年齡（65.32.2）歲。所有患者經(jīng)醫(yī)學(xué)圖像及病理學(xué)檢查符合前列腺癌的臨床診斷標準，癌癥病程情況為T2bT3a期21例，T3bT4期9例。
1.2 方法
1.2.1 掃描方法 所有患者檢查當(dāng)天清晨保持空腹?fàn)顟B(tài)。醫(yī)學(xué)圖像掃描前1 h飲用1.5%泛影葡胺水（金陵藥業(yè)股份有限公司浙江天峰制藥廠，生產(chǎn)批號：國藥準字H33021004），掃面前15 min肌肉注射15 mg鹽酸山莨菪（國藥集團容聲制藥有限公司，生產(chǎn)批號：國藥準字H41023400）。由本科專業(yè)醫(yī)師操作行CT掃描，掃描范圍從第3腰椎至坐骨結(jié)節(jié)下緣約 5 cm。患者于第二天CT掃描時間短進行MRI掃描，掃描前1 h喝800 ml溫開水，其他操作與CT掃描一致。
1.2.2 放療靶區(qū)勾畫 運用圖像配準軟件對CT掃描及MRI掃描圖像進行配準，并將配準圖片傳入放療計劃系統(tǒng)，根據(jù)CT及CT-MRI融合圖像勾畫患者前列腺、精囊的體積，并勾畫出膀胱、直腸、股骨頭周圍的正常組織。對勾畫的腫瘤體積進行化療，化療劑量根據(jù)照射體積計算。比較患者CT圖像與融合圖像放療靶區(qū)體積大小，以及各部位的照射劑量。
1.3 統(tǒng)計方法
采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用（x±s）表示，行t檢驗，P
2 結(jié)果
2.1 腫瘤體積勾畫體積比較
50例患者采用CT圖像勾畫的腫瘤體積為（72.45±2.35）mm3，采用CT-MRI融合圖像勾畫的腫瘤體積為（51.12±2.12）mm3，CT-MRI融合圖像確定的腫瘤靶細胞范圍更加精準。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.424，P
2.2 放療照射劑量比較
對膀胱、直腸等部位的照射劑量選擇上，CT圖像技術(shù)的放療最小照射量為與最大照射量均大于CT-MRI融合圖像的放療照射劑量，（詳見表1）。采用CT圖像與CT-MR融合技術(shù)，兩組數(shù)據(jù)比較：膀胱最小照射劑量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.456，P
3 討論
3.1 醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)的應(yīng)用討論
3.1.1 幾種主要的醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù) 目前臨床成像設(shè)備主要有CT、MRI、SPECT、PET等[3]，為臨床提供多模態(tài)的醫(yī)學(xué)圖像。圖像融合技術(shù)在放療中的應(yīng)用主要有：①CT與MRI融合。CT圖像應(yīng)用于腫瘤放療中對高密度組織比較敏感，圖形穩(wěn)定不易發(fā)生變形的優(yōu)點，但對軟組織邊界顯示不清晰[4]。MRI圖像則提供了較高的空間分辨度，對浸潤性腫瘤軟組織更加敏感，能清晰顯示圖像的邊界。二者的融合對某些特殊部位，如腦部、前列腺要求精度更高的靶區(qū)位置時，圖像融合就起到了互補作用，可以幫助醫(yī)師確定腫瘤邊界。②CT與MRSI融合[5]。在膠質(zhì)瘤的放療中，MRI圖像技術(shù)對腫瘤的局部控制和復(fù)發(fā)控制效果不明顯。MRSI技術(shù)相比于MRI技術(shù)能更加清楚顯示腫瘤位置及形狀，還可以同時顯示代謝水平的有關(guān)信息。CT與MRSI融合能提高部分腫瘤的控制效果。③ CT與PET融合[6]。腫瘤細胞具有增殖快、轉(zhuǎn)移速度快的特點，PET可以根據(jù)失蹤化合物在組織內(nèi)的濃度，對比腫瘤細胞的增殖及代謝水平。PET顯示的活性腫瘤區(qū)域圖像與CT圖像圖像融合技術(shù)可提高圖像對腫瘤病灶的敏感性和特異性，有助于指導(dǎo)精確腫瘤化療區(qū)域與化療藥物的劑量控制。
3.1.2 醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)操作步驟 第一，預(yù)處理。醫(yī)學(xué)圖像預(yù)處理是對選定的圖像信息進行增強對比度、噪聲去除、統(tǒng)一圖像大小、格式、分辨率，對感興趣區(qū)域進行分割等各項處理[7]。
第二，圖像配準。配準首先應(yīng)選擇適合的圖像特征量進行圖像特征提取；再根據(jù)圖像的特征量確定幾何變換，以相似性測度函數(shù)檢驗所選圖像與參考圖像的相似程度，并通過改變參數(shù)使測度函數(shù)值達到最優(yōu)，最后執(zhí)行整體變換。
第三，創(chuàng)建融合圖像。首先應(yīng)進行圖像數(shù)據(jù)的融合，以圖像為基礎(chǔ)的融合是通過各種圖像預(yù)處理方法使圖像最終呈現(xiàn)的效果達到最佳，以像素為基礎(chǔ)的融合即盡量提高圖像清晰度。完成圖像數(shù)據(jù)融合后，最終通過偽彩色顯示法、斷層顯示法和三維顯示法等顯示方法使臨床醫(yī)師能夠通過直觀的圖像進行疾病診斷。
3.2 該次研究結(jié)果討論
醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)使傳統(tǒng)化療計劃的確定擺脫了單一模態(tài)數(shù)據(jù)指引，以不同圖像技術(shù)的優(yōu)點彌補不同技術(shù)存中在的不足，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。醫(yī)學(xué)圖像融合技術(shù)應(yīng)用于腫瘤放射治療，可確定腫瘤分布位置，有效提高診斷準確性與靈活性，對惡性腫瘤的控制與提高患者生存率具有重要意義。
該次研究中采用CT-MRI融合圖像確定前列腺癌強調(diào)放療靶區(qū)的應(yīng)用中，可以看到，CT圖像勾畫的腫瘤體積為（72.45±2.35）mm3，采用CT-MRI融合圖像勾畫的腫瘤體積為（51.12±2.12）mm3，CT-MRI融合圖像確定的腫瘤靶細胞范圍更加精準。另外，腫瘤靶細胞區(qū)域的體積大小與放療照射劑量密切相關(guān)，放療區(qū)域確定越大，使用的放療劑量越多，對患者身體造成的危害更大。CT-MRI融合圖像放療劑量明顯少于CT圖像，化療的毒副作用更少。該次研究與胡玉蘭等[8]關(guān)于CT-MRI融合圖像確定前列腺癌放療靶區(qū)的結(jié)果具有一致性，認為可以利用圖形融合技術(shù)進行靶區(qū)勾勒，以減小誤差。
綜上所述，醫(yī)學(xué)融合技術(shù)在腫瘤放療中已有廣泛應(yīng)用，各種醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)取長補短，提高了診斷的靈敏度和準確性。
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【摘要】 目的 觀察樟腦丸揮發(fā)環(huán)境對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法 將40只小鼠分為2大組（Ⅰ、Ⅱ組），每大組20只小鼠，Ⅰ組進行跳臺實驗，Ⅱ組進行避暗實驗。每大組再均分為樟腦丸環(huán)境組和對照組，每組10只，分別置于樟腦丸揮發(fā)環(huán)境中3 h后立即取出和正常環(huán)境中，24 h后對2組小鼠進行跳臺實驗和避暗實驗，記錄、比較各組小鼠的潛伏期和錯誤次數(shù)。結(jié)果 樟腦丸環(huán)境組小鼠的錯誤次數(shù)較對照組增多（P
【關(guān)鍵詞】 合成樟腦丸；對二氯苯；學(xué)習(xí)記憶；跳臺實驗；避暗實驗
目前，許多市民選用樟腦丸進行防蟲、防蛀、防霉，而市面上的樟腦丸均以對二氯苯（p-dichlocrobenzene）為原料合成，人體可通過呼吸系統(tǒng)、皮膚接觸等攝入一定量的對二氯苯。進入體內(nèi)的對二氯苯會對神經(jīng)、血液系統(tǒng)造成損害，對孕婦、小孩影響則更大，誤食甚至導(dǎo)致死亡。有文章指出，長時間接觸對二氯苯可能會導(dǎo)致皮膚癌、白血病、喉癌、胃癌以及結(jié)腸癌［1］。樟腦丸對學(xué)習(xí)記憶的影響還未見報道。所以本實驗擬采用跳臺法觀察小鼠在樟腦丸揮發(fā)環(huán)境中滯留一段時間后，其學(xué)習(xí)記憶能力是否受損，以此來闡明樟腦丸揮發(fā)氣體（主要成分為對二氯苯）能否對大腦功能造成損傷。
1 材料和方法
1．1 實驗用品
“櫻之花”牌樟腦丸，源達日化有限公司2007年5月生產(chǎn)。
1．2 實驗動物
昆明種小鼠40只，體重（18±2） g，雌雄各半，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。
1．3 實驗儀器 YLS-3T型跳臺儀，安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司研制。用不透明深灰色塑料分隔成5室，每室120 mm×120 mm×180 mm，電柵電壓100 V， 電流0.05～2.0 mA。每間室右后角置一絕緣平臺（高4.5 cm）作為動物回避電擊的安全臺。ZH-500型小鼠避暗儀，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司研制，實驗裝置分明暗兩室，兩室之間有一直徑為3 cm大小的圓洞，兩室底部均鋪以銅柵，暗室接電。
1．4 實驗方法
1．4．1 建立樟腦丸環(huán)境
取24 cm×15 cm×14 cm的鼠籠，在其內(nèi)部均勻放置20粒樟腦丸（約60 g），鼠籠上方用紙覆蓋，建立模擬樟腦丸揮發(fā)環(huán)境。
1．4．2 跳臺實驗
實驗前3天使小鼠熟悉實驗室環(huán)境，室內(nèi)保持安靜，溫度25℃。實驗時將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)5 min后，然后通以0.25 mA電流，將小鼠置于跳臺上，小鼠有從高處跳下的習(xí)性，如果跳下則受到電擊而產(chǎn)生記憶。訓(xùn)練時跳臺潛伏期大于180 s者棄去不用，記錄小鼠3 min內(nèi)從平臺跳下的次數(shù)（錯誤次數(shù)），以錯誤次數(shù)作為基礎(chǔ)成績將小鼠分成2組(樟腦丸環(huán)境組和對照組)，每組10只，使2組小鼠智力水平接近。分組后將樟腦丸環(huán)境組小鼠放入樟腦丸揮發(fā)環(huán)境中3 h后立即取出，24 h后對2組小鼠進行跳臺實驗，記錄各組小鼠第1次跳下平臺的時間（潛伏期）和3 min內(nèi)的錯誤次數(shù)。測試時若小鼠停留在平臺上超過3 min，錯誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為180 s［2］。
1．4．3 避暗實驗
實驗前3天使小鼠熟悉實驗室環(huán)境，室內(nèi)保持安靜，溫度25℃。訓(xùn)練時先將小鼠放入反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min，然后暗室底部銅柵通40 V、50 Hz交流電。將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進入暗室則受到電擊。訓(xùn)練時避暗潛伏期大于180 s者棄去不用。記錄5 min內(nèi)第1次進入暗室的時間(潛伏期)和進入次數(shù)(錯誤次數(shù))，以錯誤次數(shù)作為基礎(chǔ)成績將小鼠分成2組(樟腦丸環(huán)境組和對照組)，每組10只，使各組小鼠智力水平接近。分組后將樟腦丸環(huán)境組小鼠放入樟腦丸揮發(fā)環(huán)境中3 h后立即取出，24 h后對2組小鼠進行避暗實驗，記錄小鼠第1次進入暗室的時間和5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)。測試時如果5 min內(nèi)小鼠仍未進入暗室，錯誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s［2］。
1．5 統(tǒng)計學(xué)處理
錯誤次數(shù)和潛伏期用±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗組和對照組的比較采用成組t檢驗，檢驗水準：α=0.05。
2 結(jié) 果
2.1 跳臺實驗小鼠的錯誤次數(shù)和潛伏期的比較
見表1。結(jié)果表明，樟腦丸環(huán)境組小鼠錯誤次數(shù)比對照組多（P＜0.01），潛伏期比對照組短（P＜0.05）。表1 跳臺實驗2組小鼠比較（略）
2.2 避暗實驗小鼠的錯誤次數(shù)和潛伏期的比較
見表2。樟腦丸環(huán)境組小鼠錯誤次數(shù)比對照組多（P＜0.01），潛伏期比對照組短（P＜0.05）。表2 避暗實驗2組小鼠比較（略）
3 討 論
學(xué)習(xí)記憶是腦的高級神經(jīng)生理活動之一，是衡量動物智力發(fā)育的重要指標。 學(xué)習(xí)記憶既是認知活動中的重要方面，也是智力結(jié)構(gòu)中的重要要素。
我國自從發(fā)現(xiàn)萘具有致癌作用而被禁止用作防蛀劑生產(chǎn)和銷售以后，近年來，防霉防蛀劑大多以對二氯苯為原料制作。因其價格低廉，效果尚可，在市場上占絕對優(yōu)勢。1987年國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將對二氯苯列為人類可能致癌物。有關(guān)資料顯示，使用對二氯苯防蛀片進行急性毒性研究，實驗動物染毒后出現(xiàn)不同程度中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，表現(xiàn)為四肢無力、癱軟、厭食、毛蓬松、腹式呼吸等癥狀。人類接觸高濃度對二氯苯后也表現(xiàn)出虛弱、眩暈、嘔吐等中樞神經(jīng)抑制現(xiàn)象［3］。
本實驗結(jié)果表明，置身于合成樟腦丸揮發(fā)環(huán)境中后，小鼠產(chǎn)生了逆行性遺忘現(xiàn)象，即其學(xué)習(xí)記憶能力受到損傷，提示此環(huán)境干擾大腦功能。鑒于此，建議消費者應(yīng)選用以天然樟腦和擬除蟲菊酯為原料生產(chǎn)的安全防蟲防蛀產(chǎn)品，即便使用合成樟腦丸保存衣物，穿時應(yīng)晾曬一段時間，讓有害物質(zhì)揮發(fā)干凈；如周圍環(huán)境中有合成樟腦丸，一定保持通風(fēng)狀態(tài)。
【參考文獻】
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(廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東510407)
摘 要 采用4-血管阻斷模型,用Morri水迷宮測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,并檢測大鼠腦組織內(nèi)SOD酶活性及MDA含量。結(jié)果電針及尼莫同治療組能顯著縮短定位航行試驗的潛伏期;在空間探索試驗中,在原平臺象限跨越平臺次數(shù)顯著多于其余象限,與正常組無顯著差異;大鼠腦組織內(nèi)SOD酶活性上升,MDA含量明顯降低。提示電針能改善VD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并能增強機體清除自由基的能力,對阻止自由基對腦組織的進一步損害有積極意義。
主題詞 電針 癡呆,血管性/針灸療法 學(xué)習(xí)障礙/針灸療法 記憶障礙/針灸療法 超氧化物歧化酶/代謝 丙二醛/分析 血管性癡呆(VascularDementia,VD)是我國最常見的老年期癡呆類型,系由腦血管因素引起的腦循環(huán)障礙、腦組織受損導(dǎo)致的一種認知功能缺損的綜合征。由于癡呆造成病人記憶、認知等方面的障礙,不僅影響病人的生活質(zhì)量,而且造成巨大的社會和家庭負擔(dān),本病成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)緊迫攻關(guān)的課題之一。在對血管性癡呆的發(fā)病機制尚未完全搞清、臨床缺乏理想藥物的情況下,針灸對VD的智能及社會活動功能康復(fù)有積極作用,其療效肯定,但有關(guān)機理方面的實驗研究尚缺乏[1],我們采用4-血管阻斷(4-Vesselocclusion,4-VO)全腦缺血模型,模擬臨床上VD的發(fā)病特點,建立近似人類學(xué)習(xí)記憶障礙的大鼠VD模型,觀察電針對模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、腦內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量的影響,旨在探討針刺治療血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機理。
1 材料1.1 動物及分組成年健康雄性SD大鼠40只,體重200～250g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供。按體重隨機分為正常組、電針組、西藥組和模型組,每組各10只。
1.2 儀器Morris水迷宮,722分光光度計(上海第二分析儀器廠產(chǎn)品),G8605電針儀(上海)。
1.3 藥品及試劑尼莫同(由德國拜耳公司提供,批號:CAGFT3)、SOD、MDA、總蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)。
2 方法2.1 模型制作方法模型組、電針組、西藥組動物按4-血管阻斷(4-Vesselocclusion,4-VO)方法制作模型。用10%水合氯醛(0.6ml/100g體重)腹腔麻醉大鼠,背側(cè)頸正中切口,暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔,用直徑0.5mm電凝針插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動脈,造成永久性閉塞,24小時后腹側(cè)頸正中切口,分離雙側(cè)椎動脈,用微動脈夾可逆性夾閉頸總動脈5min,共夾閉3次,每次間隔1小時,常規(guī)飼養(yǎng)、觀察。正常組常規(guī)飼養(yǎng),未經(jīng)任何處理。
2.2 治療方法術(shù)后7天,刀口完全愈合,飲食正常,無肢體殘疾,開始給予治療。
(1)電針組 用28號1寸毫針,于模型大鼠頭部"百會"、"大椎"穴(取穴參照林文注等編著的《實驗針灸學(xué)》)捻入0.5寸,連接電針儀,該項目為廣東省自然科學(xué)基金資助項目(960548)
施以連續(xù)波,頻率150Hz,強度以大鼠安靜耐受為度(約2.0A),于每天電針1次,留針20min,連續(xù)治療10天。
(2)西藥組 大鼠給予尼莫同12mg/kg,按20ml/kg體重灌胃,每日1次,連續(xù)10天。
(3)正常組和模型組未予任何治療。
2.3 檢測方法(1)Morris水迷宮行為學(xué)檢測[2]水迷宮由直徑130cm、高50cm水池組成,水深30cm,水溫26±1℃。在水池壁標明4個入水點,由此將水池等分為4個象限,任一象限正中放置一個直徑12cm、高29cm無色透明的平臺,沒于水下1cm,水面覆蓋塑料泡沫,于術(shù)后第18天開始水迷宮試驗。程序包括(1)定位航行試驗(placetest),歷時6天,每天4次,將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中,記錄2min內(nèi)尋找平臺的時間(逃避潛伏期,es-capelatency);(2)空間探索試驗(spatialprobetest):定位航行試驗結(jié)束后撤除平臺,然后將鼠任選一入水點放入水中,測其2min內(nèi)跨原平臺及其余3個象限相應(yīng)平臺位置的次數(shù)和大鼠在水迷宮外環(huán)停留時間。
(2)生化指標檢測水迷宮試驗結(jié)束后,大鼠脫椎法處死,迅速斷頭取腦用預(yù)冷的生理鹽水沖凈表面血液,以濾紙吸干,去除軟腦膜血管,取右腦稱重,以重量/體積(W/V)比1∶9加入冰生理鹽水,制成10%的勻漿,3000r/min離心15min,取上清液。磺嘌呤氧化酶法測SOD活性,硫代巴比妥酸法測MDA含量,Lowry法測組織蛋白含量,嚴格按照試劑盒說明進行操作。
3 結(jié)果3.1 行為學(xué)檢測結(jié)果測試時大鼠飲食正常,體重恢復(fù)到原有水平,無肢體殘疾。
(1)定位航行試驗4組大鼠在歷時6天訓(xùn)練中,尋找平臺的平均潛伏期變化(見圖1)。
如圖1所示,正常組、電針組和西藥組大鼠均隨著訓(xùn)練次數(shù)增加,潛伏期越來越短。每組組內(nèi)潛伏期經(jīng)單因素方差分析,有非常顯著性意義(P0.05),平均潛伏期69.67s。這表明模型組大鼠學(xué)習(xí)獲取能力較差。將4組大鼠平均潛伏期進行組間單因素方差分析,有非常顯著性差異(P
(2)空間探索試驗撤除平臺,4組大鼠2min內(nèi)跨越原平臺及其余3個象限相應(yīng)平臺位置次數(shù)(見圖2)。
如圖2所示,正常組大鼠在原平臺象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)為6.2次,其余R、O、L3個象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)分別為1.4,0.8,1.0;電針組大鼠在原平臺象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)為6次,其余R、O、L3個象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)分別為1.8,0,0.3;西藥組大鼠在原平臺象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)為5.5次,其余R、O、L3個象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)分別為1.3,0.8,0.5,3組在原平臺象限跨相應(yīng)平臺次數(shù)明顯多于其余3個象限(P0.05)。將4組大鼠在原平臺象限跨越相應(yīng)平臺次數(shù)做兩兩比較,電針組明顯多于模型組(P0.05)。在水迷宮外環(huán)逗留時間正常組平均為40.3s,電針組為40.4s,西藥組為47.5s,模型組為75.8s,模型組逗留時間比其它3組明顯延長(P0.05;與模型組比較,P
4 討論隨著社會的老齡化,血管性癡呆已成為日益嚴重的社會問題,目前尚未找到改變疾病進程的方法,但是國內(nèi)外學(xué)者一直在研究。在基礎(chǔ)研究中認為反復(fù)性腦缺血是VD的主要病因之一[3,4],而自由基是腦缺氧后神經(jīng)細胞損害的重要發(fā)病因素。自由基生成系統(tǒng)對學(xué)習(xí)記憶亦有明顯的損害作用,自由基對腦缺血的損傷是多方面的,無論是對急性期腦血管或腦實質(zhì)損傷,還是腦血管損傷后的繼發(fā)性損傷均起重要作用。它對智力的損害主要由于自由基對細胞及細胞膜上不飽和脂肪酸的破壞和過氧化及MDA產(chǎn)生。MDA是自由基對生物細胞膜損傷和主要代謝產(chǎn)物,它能交鏈蛋白質(zhì)、脂類、核酸及糖類,致使生物膜變性和破壞,由于DNA發(fā)生突變、交鏈等影響了信息傳遞、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成能力或合成蛋白質(zhì)功能紊亂,從而表現(xiàn)出記憶力和智力下降。SOD是重要的金屬酶,為機體直接清除自由基的重要酶類,是機體防御新陳代謝及其他生命活動中氧自由基損傷和破壞的抗氧化酶[5]。其主要功能是將氧的單價還原產(chǎn)物O-2?歧化成H2O,以免它們分解形成強氧化活性的自由基重新對其它不飽和脂肪酸分子發(fā)生氧化作用,從而阻斷自由基損傷[6,7]。臨床報道表明[1],針灸治療VD的療效是肯定的,但是基礎(chǔ)理論和實驗方面的報道很少見。本實驗采取被廣泛應(yīng)用的4-血管阻斷法(4-VO),引起全腦缺血,其中有再灌注損傷,和人類血管性癡呆的發(fā)病機理有很大的相似性。實驗結(jié)果亦表明,缺血再灌注損傷后,實驗動物出現(xiàn)明顯記憶障礙,大鼠腦組織的SOD活性明顯下降,MDA含量明顯增加。我們采取電針大鼠"百會"、"大椎"穴,檢測其學(xué)習(xí)記憶行為,結(jié)果表明,能縮短模型大鼠水迷宮潛伏期,能改善其記憶成績。通過對SOD活性和MDA含量的檢測,結(jié)果表明電針能增強癡呆大鼠腦內(nèi)SOD活性和降低MDA含量。"百會"和"大椎"均為督脈穴位,百會為"三陽五會",大椎為"諸陽之會",督脈與腦密切相關(guān),督脈通于腦。病變在腦,首取督脈。電針2穴能疏通經(jīng)氣、通調(diào)督脈、醒腦開竅、益智復(fù)聰。實驗結(jié)果表明電針能明顯改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,對阻止自由基對腦組織的進一步損害有積極意義。
【關(guān)鍵詞】 咪達唑侖 氯胺酮 跳臺實驗 避暗實驗 學(xué)習(xí)記憶
現(xiàn)代麻醉學(xué)已經(jīng)取得了長足的進步，尤其在鎮(zhèn)痛和肌松方面，但使用麻醉藥后“術(shù)中知曉”問題卻困擾著醫(yī)療界。國外術(shù)中知曉的發(fā)生率約為0.07%～8%［1-2］，國內(nèi)約2%，心臟手術(shù)高達6%［3］。問卷調(diào)查表明，幾乎所有的麻醉醫(yī)生都承認他們實施過麻醉的患者中發(fā)生過全麻知曉，其發(fā)生率比我們所承認的要高出很多。在足夠的麻醉深度下，聽覺認知過程可能仍然存在，不良印象或傷害性評論可被患者記住，如表現(xiàn)為顯性記憶，患者可能訴訟引起醫(yī)療糾紛；如表現(xiàn)為隱性記憶，可能導(dǎo)致心理創(chuàng)傷。所以消除在手術(shù)中產(chǎn)生的痛苦記憶是現(xiàn)代麻醉學(xué)的重要課題。本研究通過觀察小劑量的咪達唑侖或氯胺酮1次單用和2藥合用能否產(chǎn)生遺忘作用，從而為減輕或消除“術(shù)中知曉”提供用藥依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 實驗動物和分組 昆明種小鼠80只，體重18～22 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。均分為2大組（n=40）。每大組按隨機分層區(qū)組設(shè)計分成4組（n=10）：生理鹽水組（NS組）、咪達唑侖組（M組）、氯胺酮組（K組）、咪達唑侖+氯胺酮組（MK組）。使各組雌雄比例和平均體重基本一致。
1.2 實驗藥品和儀器 咪達唑侖注射液（徐州恩華藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：5 ml:5 mg，批號：20070209）；鹽酸氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：2 ml:0.1 g，批號：KH041107）。2藥均用生理鹽水稀釋成所需濃度。YLS-3T型跳臺儀、ZH-500型小鼠避暗儀均為安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司研制。
1.3 實驗方法
1.3.1 給藥方法和劑量 NS組腹腔注射生理鹽水（10 ml/kg），5 min后皮下注射等容積的生理鹽水；M組腹腔注射咪達唑侖（0.15 mg/kg），5 min后皮下注射生理鹽水（10 ml/kg）；K組腹腔注射生理鹽水（10 ml/kg），5 min后皮下注射氯胺酮（0.5 mg/kg）；MK組腹腔注射咪達唑侖（0.15 mg/kg），5 min后皮下注射氯胺酮（0.5 mg/kg）。各組第2次給藥后5 min分別用跳臺儀和避暗儀進行學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練。
1.3.2 跳臺實驗 將小鼠放在跳臺儀各室的絕緣臺適應(yīng)環(huán)境5 min，10 s不從高處跳下，即將跳下習(xí)性不明顯的小鼠剔除。各組小鼠依次給完藥后5 min重新放在絕緣臺上，此時絕緣臺下的電柵通以0.25 mA的電流。各小鼠從絕緣臺跳下受1次電擊取出。24 h后進行跳臺實驗，記錄各組小鼠第1次跳下平臺的時間（潛伏期）和3 min內(nèi)的跳下次數(shù)（錯誤次數(shù)）。測試時若小鼠停留在平臺上超過3 min，潛伏期計為180 s，錯誤次數(shù)計為0次［4］。
1.3.3 避暗實驗 將小鼠背對洞口放在避暗儀各室的明室后適應(yīng)環(huán)境5 min，10 s不進入暗室，即將驅(qū)暗習(xí)性不明顯的小鼠剔除。各組小鼠依次給完藥后5 min重新放入明室，此時暗室底部銅柵通以32 V交流電，各小鼠進入暗室受到1次電擊取出。24 h后進行避暗實驗，記錄各組小鼠第1次進入暗室的時間（潛伏期）和3 min內(nèi)的進入暗室的次數(shù)（錯誤次數(shù)）。測試時若小鼠停留在明室超過3 min，潛伏期計為180 s，錯誤次數(shù)計為0次［4］。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 錯誤次數(shù)及潛伏期均用±s表示，用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用t檢驗，檢驗水準：α=0.05。
2 結(jié) 果
2.1 跳臺實驗結(jié)果 M組和K組的潛伏期和錯誤次數(shù)與NS組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。MK組較其它各組潛伏期明顯縮短（P
2.2 避暗實驗結(jié)果 M組或K組的潛伏期和錯誤次數(shù)與NS組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。MK組較NS組潛伏期明顯縮短（P
3 討 論
遺忘也稱記憶的空白、回憶的消失，是指局限于某一事件或某一時間內(nèi)經(jīng)歷的遺忘。遺忘可分為順行性遺忘與逆行性遺忘、進行性遺忘、心因性遺忘、近事遺忘與遠事遺忘。咪達唑侖是苯二氮艸卓類的代表藥物之一，其受于神經(jīng)元突觸膜上，在腦的顳葉、枕葉和邊緣系統(tǒng)含量較高［5］，該受體激動后產(chǎn)生抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、肌松和順行性遺忘作用。迷達唑侖本身無鎮(zhèn)痛作用，但可增強其他麻醉藥的鎮(zhèn)痛作用，其特點為起效迅速，作用短暫。氯胺酮是具有鎮(zhèn)痛作用的靜脈麻醉藥，為非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗藥，可產(chǎn)生明顯的順行性遺忘作用。咪達唑侖常作為麻醉前用藥與氯胺酮合用，原因是氯胺酮雖然具有良好的麻醉鎮(zhèn)痛功效，但它容易出現(xiàn)精神運動性反應(yīng)，咪達唑侖可部分抑制這一反應(yīng)，同時可減少麻醉藥的用量。
這兩種藥單用達到一定劑量均可損傷學(xué)習(xí)記憶的功能［6-7］。本次實驗發(fā)現(xiàn)，1次單用小劑量的咪達唑侖或氯胺酮對小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷不明顯，2藥小劑量合用可使小鼠學(xué)習(xí)記憶明顯減退，說明2藥有協(xié)同作用。本結(jié)果提示，在臨床麻醉中可小劑量合用氯胺酮與咪達唑侖增強患者的遺忘以減少或消除術(shù)中知曉和術(shù)后回憶，而不是單純增加1種藥物的劑量。麻醉要求達到催眠無回憶和阻斷傷害性刺激反應(yīng)，如果僅盲目地加深麻醉程度以達到避免和預(yù)防術(shù)中知曉，其結(jié)果可能會給患者帶來嚴重的不良反應(yīng)。本實驗通過小劑量聯(lián)合使用麻醉藥減少或消除術(shù)中知曉的方法，旨在對臨床合理用藥提供些許幫助。
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【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；大鼠關(guān)節(jié)炎模型；益氣補腎活血方；雷公藤多苷；IL-10；IL-17
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的自身免疫性疾病。我們根據(jù)全國名老中醫(yī)陳湘君教授治療 RA的經(jīng)驗，篩選益氣補腎活血中藥對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠進行早期干預(yù)治療，觀察益氣補腎活血方對早期RA外周血中細胞因子的影響，以探討該復(fù)方防治RA的作用機制和作用靶點。
1 實驗材料
1.1 實驗動物 SD大鼠40只，5周齡，雌性，體質(zhì)量（150±30）g，SPF級，由西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，使用許可證：SCXK（滬）2012-0005。
1.2 試劑及藥物 弗氏完全佐劑（Freund's Adjuvant Complete，F(xiàn)CA），美國Sigma公司產(chǎn)品。白細胞介素-10（IL-10）和白細胞介素-17（IL-17）試劑盒，購自上海西唐生物科技有限公司。益氣補腎活血方由生黃芪30 g、生白術(shù)10 g、白芍30 g、骨碎補15 g、巴戟肉20 g、土鱉蟲12 g組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中藥制劑室按既定工藝完成并提供。雷公藤多苷片，黃石飛云制藥有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號20070601。
2 方 法
2.1 動物分組 由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實驗動物中心負責(zé)飼養(yǎng)大鼠，按隨機數(shù)字表分為空白對照組、模型對照組、雷公藤多苷組和益氣補腎活血方組，每組10只。
2.2 造模方法 采用常規(guī)的佐劑關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠造模方法。于每只大鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL
弗氏完全佐劑，空白對照組注射生理鹽水0.1 mL。
2.3 給藥方法 造模第14 天開始灌胃給藥?？瞻讓φ战M和模型對照組：按10 mL?kg-1 ig予以生理鹽水，每日1次。雷公藤多苷組：將雷公藤多苷片研成細末，用滅菌蒸餾水配制成混懸液（1 mL內(nèi)含雷公藤多苷0.36 mg），按3.6 mg?kg-1ig，每日1次。益氣補腎活血方組：將益氣補腎活血方常規(guī)煎煮并濃縮生藥濃度為480 mg?mL-1，按
4 800 mg?kg-1ig，每日1次。每組均給藥50 d。
2.4 檢測指標
2.4.1 大鼠體質(zhì)量 每7～10天稱量體質(zhì)量1次。
2.4.2 關(guān)節(jié)腫脹度 以排水法測量大鼠左右后足體積，于造模后第1，7，14，21，30，40，50天各測量1次。足體積計算方法為：各組所有大鼠左后足體積之和/大鼠數(shù)量。
2.4.3 細胞因子IL-10和IL-17檢測方法 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法測定大鼠血清中IL-10和IL-17的水平，嚴格按照試劑盒說明書要求操作。
2.5 實驗原理 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 IL-10 或IL-17單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 IL-10 或IL-17與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠IL-10或IL-17，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測OD值，IL-10或IL-17濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中IL-10或 IL-17濃度。
2.6 樣本收集 ①收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2～8 ℃保存48 h；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。②標準品液配制：使用前加入1 mL蒸餾水混勻，配成20 ng?mL-1的溶液。設(shè)標準管8管，第1管加標本稀釋液900 μL，第2至第8管加入標本稀釋液500 μL。在第1管中加入20 ng?mL-1的標準品溶液100 μL混勻后用加樣器吸出500 μL，移至第
2管。如此反復(fù)做對倍稀釋，從第7管中吸出500 μL
棄去。第8管為空白對照。③10×標本稀釋液用蒸餾水作1∶10倍稀釋（示例：1 mL濃稀釋液+
9 mL蒸餾水）。④洗滌液：用重蒸水1∶20稀釋（示例：1 mL濃縮洗滌液加入19 mL的重蒸水）。
2.7 標本檢測程序 ①加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃
120 min。②洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。③每孔中加入第一抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃60 min。④洗板：同前。⑤每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板置37 ℃30 min。⑥洗板：同前。⑦每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min。
⑧每孔加入100 μL終止液混勻。⑨30 min內(nèi)用酶標儀在450 nm處，測吸光值。
2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
3 結(jié) 果
3.1 大鼠體質(zhì)量變化 造模第1天和第7天，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。造模第13天，空白對照組大鼠體質(zhì)量最重，與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。各組大鼠實驗后體質(zhì)量較實驗前均有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。從各組大鼠體質(zhì)量增加幅度來看，雷公藤多苷組>空白對照組>益氣補腎活血方組>模型對照組。其中模型對照組體質(zhì)量增加幅度最小，與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。其余各組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。
3.2 大鼠左后足體積變化 造模第1天各組大鼠左后足體積無明顯差異，造模第7天開始到實驗結(jié)束，空白對照組左后足體積始終小于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；造模第40天，模型對照組體積大于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義
（P < 0.01）；治療后，各組大鼠左后足體積較前均有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；從體積變化幅度來看，各組組間比較，空白對照組體積增加最小，與其他各組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。
3.3 大鼠右足體積變化 與左后足體積變化相似。空白對照組在造模后右后足未出現(xiàn)腫大。造模第
1天和第7天，空白對照組右后足與其他各組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；造模第14天后，除空白對照組外，其他各組右后足均出現(xiàn)不同程度腫脹，空白對照組均低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；模型對照組在30 d后右后足體積大于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；各組較實驗前右后足體積均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。
3.4 各組大鼠IL-10和IL-17的變化 治療后，模型對照組IL-17水平明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；模型對照組IL-10水平均低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。提示益氣補腎活血方能明顯降低細胞因子IL-17水平，顯著提高IL-10的水平。見表4。
4 討 論
RA是以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性疾病，在其發(fā)展過程中滑膜增殖形成血管翳，造成對骨關(guān)節(jié)的侵襲破壞，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)強直、畸形、功能喪失而出現(xiàn)不同程度的殘疾。IL-17作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種致炎因子，主要由活化的記憶性CD4+T淋巴細胞分泌。IL-17參與RA炎癥及骨破壞過程，一方面IL-17是強大的促炎性細胞因子，具有促進組織炎癥，另一方面可以通過刺激金屬基質(zhì)蛋白酶的生成促發(fā)細胞外基質(zhì)損傷，抑制修復(fù)基質(zhì)的成分如蛋白聚糖和膠原，進一步促進破骨細胞活化，導(dǎo)致破骨細胞增生，加重骨的損傷。Cai L等[1]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可誘發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，并加重滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞；Bush KA等[2]發(fā)現(xiàn)，可溶性的IL-17受體及特異性的抑制劑阻斷內(nèi)源性IL-17的作用，能夠減輕自身免疫、膠原或佐劑誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)損傷程度，減少RA滑膜及骨組織IL-6和II型膠原降解標志物的釋放。前瞻性研究也重點提出IL-17在RA致病中的作用，滑膜中IL-17 mRNA水平可預(yù)測關(guān)節(jié)破壞病變的嚴重程度[3]。有文獻報道，細胞因子IL-10對RA動物模型具有明顯保護作用，無論在RA發(fā)病前后，使用IL-10都能明顯減輕由膠原和鏈球菌細胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹、浸潤、細胞因子合成和軟骨變形壞死，IL-10的這一作用可能與抑制滑膜巨噬細胞和T細胞合成炎性細胞因子有
關(guān)[4-5]。IL-10有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能抑制RA的病理免疫進程。
RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。陳湘君教授承《濟生方?諸痹門》中“皆因體虛，腠理空疏，受風(fēng)寒濕氣而成痹也”之理論，結(jié)合40年的臨床經(jīng)驗認為，RA是一個本虛標實之病，本虛主要為衛(wèi)氣虧虛及肝脾腎不足，標實則為外感之風(fēng)寒濕熱之邪及后期之痰濕瘀血交阻，因此RA發(fā)病與衛(wèi)氣虧虛、肝脾腎不足有關(guān)，在此基礎(chǔ)上，可合并濕熱或寒濕之邪而發(fā)病，后期則往往挾痰濕或瘀血。因此，衛(wèi)氣虧虛、肝腎不足是本病發(fā)生的基礎(chǔ)，瘀血阻滯是其基本的病理特征，正虛血瘀貫穿RA的始終。
根據(jù)RA上述的發(fā)病特點、病因病機，確立了以扶正（益氣補腎）為主的治療大法。具有益氣補腎、活血通絡(luò)止痛之功效。本實驗結(jié)果表明，模型對照組大鼠IL-10水平顯著降低，IL-17顯著升高，提示AA大鼠病變過程中細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡。益氣補腎活血方能顯著上調(diào)IL-10，下調(diào)IL-17，從而增強了細胞因子的抗炎效應(yīng)，抑制了細胞因子的促炎效應(yīng)，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，這可能是該復(fù)方治療RA的又一作用機制。
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關(guān)鍵詞： 瑞芬太尼；咪達唑侖；跳臺實驗；學(xué)習(xí)記憶
麻醉術(shù)中知曉(簡稱術(shù)中知曉)是一種不愉快的經(jīng)歷，可以給患者帶來不同程度的精神損傷［1］。瑞芬太尼(remifentanil，R)和咪達唑侖（midazolam，M）是臨床上常用的復(fù)合麻醉用藥。瑞芬太尼是新型超短時效阿片類鎮(zhèn)痛藥，具有麻醉平穩(wěn)、代謝不依賴肝腎功能、持續(xù)輸注無積蓄等優(yōu)點，因而優(yōu)于傳統(tǒng)阿片類藥物［2］。咪達唑侖為苯二氮艸卓類鎮(zhèn)靜催眠藥，靜脈注射起效快，持續(xù)時間短，生物利用度高，無明顯積蓄現(xiàn)象［3］。咪達唑侖可產(chǎn)生遺忘作用［4］，但兩藥合用能否加強遺忘作用國內(nèi)外鮮見報道。本研究通過跳臺實驗觀察瑞芬太尼與咪達唑侖合用對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。
1 材料和方法
1.1 實驗動物
昆明種小鼠30只，體重18～22 g，雌雄各半，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗前2天使小鼠熟悉實驗室環(huán)境，自由攝食、飲水，每日上午9:00 - 12:00進行實驗。
1.2 實驗藥品
咪達唑侖注射液（徐州恩華藥業(yè)集團有限公司, 批號20070209），鹽酸瑞芬太尼（宜昌人福藥業(yè)有限公司，批號071005)，均用生理鹽水(NS)稀釋成所需濃度。
1.3 主要儀器
YLS-3T型跳臺儀（成都泰盟科技有限公司）。
1.4 動物分組及處理
按分層隨機區(qū)組設(shè)計將小鼠分為3組：瑞芬太尼+NS組(R組)、咪達唑侖+NS組(M組)、瑞芬太尼+咪達唑侖組(RM組)，每組10只，使各組小鼠雌雄比例、平均體重基本相同。訓(xùn)練前4 min，R組和RM組皮下注射瑞芬太尼，劑量為20 μg·kg-1，M組注射NS；訓(xùn)練前2 min，M組和RM組腹腔注射咪達唑侖，劑量為1 mg·kg-1，R組注射NS；NS注射容積為0.1 ml·10 g-1。
1.5 跳臺實驗
首先將小鼠放入跳臺儀內(nèi)適應(yīng)3 min，然后底部銅柵通以0.05 mA電流，小鼠受到電擊即會跳上平臺躲避電擊，如此訓(xùn)練3 min。用藥后第1、2、3天將小鼠再次放在平臺上，記錄第1次跳下平臺的時間(潛伏期)和3 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)(錯誤次數(shù))，3 min內(nèi)未跳下平臺的小鼠，錯誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為180 s。
1.6 統(tǒng)計學(xué)處理
用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用±s表示，多組各組間比較采用單因素方差分析LSD檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
在本實驗中，用藥后第1天，與R組相比，RM組潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加（P<0.01，P<0.05），與M組相比RM組的錯誤次數(shù)增加（P<0.05）；用藥后第2天，與R組相比，RM組的潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加（P<0.05）；用藥后第3天，各組間潛伏期和錯誤次數(shù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。表1 瑞芬太尼與咪達唑侖合用對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（略）
3 討論
增強遺忘作用、防止術(shù)中知曉是麻醉手術(shù)的重要組成部分。在對腦內(nèi)記憶過程的研究中，跳臺實驗是常用的研究動物學(xué)習(xí)記憶的實驗方法［5］。
在本實驗中，用藥后第1天和第2天，瑞芬太尼與咪達唑侖合用組小鼠的記憶能力比單用組減退；用藥后第3天，各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果顯示，隨著給藥后時間的推移，各組小鼠的潛伏期有增加的趨勢，錯誤次數(shù)有減少的趨勢。表明瑞芬太尼與咪達唑侖合用不會對小鼠的學(xué)習(xí)記憶造成持久的影響。提示兩藥合用在臨床麻醉中防止術(shù)中知曉方面是合理的。
咪達唑侖具有激活GABAA受體的功能，能抑制大鼠離體海馬腦片的長時程增強［6］，對學(xué)習(xí)記憶起負性調(diào)節(jié)作用。瑞芬太尼為μ受體激動劑，而在海馬，μ受體參與了對乙酰膽堿的抑制［7］，且海馬中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性與乙酰膽堿含量呈正相關(guān)［8］。另有研究發(fā)現(xiàn)［9-10］，GABA和阿片肽系統(tǒng)在腦杏仁復(fù)合體整合，影響其β腎上腺素受體活性，再由杏仁復(fù)合體發(fā)出纖維投射到其他腦區(qū)，接著影響膽堿能系統(tǒng)而影響記憶儲存。因此，瑞芬太尼和咪達唑侖可能分別通過阿片受體和GABA間接作用于乙酰膽堿受體，抑制其釋放，從而影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶。
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【關(guān)鍵詞】 血管平滑肌細胞
關(guān)鍵詞: 反義寡核苷酸;血管平滑肌細胞;再狹窄;血小板衍化生長因子;受體;細胞核增殖抗原
摘 要:目的 研究血小板衍化生長因子β受體（PDGFR-β）反義寡核苷酸（AODN）對血管平滑肌細胞（VSMC）增殖的影響. 方法 建立大鼠血管平滑肌細胞體外增殖模型.將細胞分為反義寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、無義寡核苷酸組和空白對照組，其中反義組按濃度又分為1，2.5，5，10和15μmol L-1 5小組.在加藥后24，48和72h以流式細胞儀測定細胞周期，免疫細胞化學(xué)染色分析細胞核增殖抗原的表達，MTT（四唑鹽）比色法測定細胞增殖活力. 結(jié)果 10μmol L-1 PDGFR-βAODN干預(yù)VSMC48h后，處于DNA合成前期（G0 /G1 ）細胞數(shù)分數(shù)（0.70）高于空白對照組（0.07，P
Keywords:antisense oligonucleotide;vascular smooth muscle cell;restenosis;platelet derived growth factor;receptor;proliferating cell nuclear antigen
Abstract:AIM To study the effect of PDGFR-βAODN on proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells（VSMC）.METHODS Cultured rat aortic VSMC mod-el was established in vitro.The cells were pided into antis-ese oligonucleotide（AODN）group，sense oligonucleotide（SODN）group，scrambled oligonucleotide（CODN）group and control group.The cells in AODN group were subpided into five small groups by concentration of1，2.5，5，10，15μmol L-1 .MTT assay，flow cytometry，immunohis-tochemistry for proliferating cell nuclear antigene（PCNA）were used to determine the effects of PDGFR-βAODN on proliferation of VSMC.RESULTS The percentage of quies-cent cells（G0 /G1 ）of AODN group at48h（0.70）were much higher than that of control group（0.07），P
0 引言
經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）和冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）是治療冠心病的有效手段，但30%～50%術(shù)后再狹窄嚴重影響手術(shù)療效［1，2］ .研究證明再狹窄的實質(zhì)就是血管中層平滑肌細胞向內(nèi)膜下遷移和增生
［3］ .血小板衍化生長因子及其β受體（PDGFR-β）在血管平滑肌細胞（VSMC）的遷移增生過程中起重要作用
［4］ .我們擬探討在大鼠體外VSMC增殖模型中，PDGFR-β反義寡核苷酸（AODN）對VSMC增殖的影響.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠清潔級，4wk齡，雌雄不限，體質(zhì)量（250±20）g，4～8wk齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供;抗大鼠PCNA mAb、混合膠原酶、胰蛋白酶、MTT購于Sigma公司;96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板購于Costar公司;PDGFR-βAODN鏈（18bp）5’TAT CAC TCC TGG AAG CCC3’，正義寡核苷酸鏈（SODN）5’GGG CTT CCA GGA GTG ATA3’，無關(guān)寡核苷酸鏈（CODN）5’GTG ATA GTA TGC CGA GCA3’，由加拿大上海Sagon公司合成并進行全硫代磷酸化修飾和電泳鑒定;SABC試劑盒購于武漢博士德生物工程公司;胎牛血清購于浙江金華犢牛研究所;流式細胞儀（EFICS ELITE法國）;酶聯(lián)免疫檢測儀（DG5031，華東電子儀器廠）;SD大鼠頸椎脫臼法處死后，采用膠原酶法分離取得VSMC進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，經(jīng)α-SMactin免疫細胞化學(xué)染色鑒定確為VSMC、純度>95%，采用5～10代細胞為實驗對象.
1.2 方法
1.2.1 VSMC細胞增殖活力的測定 取生長融合期細胞制成1×104 L-1 密度的單細胞懸液接種于96孔板，待細胞完全貼壁伸展后，無血清DMEM培養(yǎng)液馴化24h.采取不同的加藥方案:①單加不同濃度的反義寡核苷酸;②加入5.0μmol L-1 反義、正義、無義寡核苷酸;③空白組加等量培養(yǎng)液，設(shè)調(diào)零孔.每24h各取8孔，每孔內(nèi)加入MTT20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后小心吸去培養(yǎng)液.每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，震蕩器震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀（波長490nm）測定各孔的吸光度值［5］ .細胞增殖抑制百分率=（1-試驗組A值）/對照組A值均數(shù)×100%.
1.2.2 PCNA免疫細胞化學(xué)染色 將5×105 L-1 密度細胞懸液，接種于已置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細胞完全貼壁伸展后，無血清DMEM培養(yǎng)液馴化24h后，加入含不同干預(yù)因素（同1.2.1）的200mL L-1 胎牛血清DMEM，每24h各取5孔，取出蓋玻片，按SABC試劑盒說明進行其余步驟操作，最后DAB顯色，常規(guī)系列脫水、透明.鏡下觀察.PCNA染色陽性標準:細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒.隨機計數(shù)5張蓋玻片中5個以上高倍鏡視野500個細胞，計算平均每100個細胞中陽性百分率，根據(jù)染色強度和范圍分為:陰性（-）:陽性細胞50%.
1.2.3 流式細胞儀測定細胞周期 將細胞制成2×105 L-1 密度的單細胞懸液，接種培養(yǎng)瓶，48h后棄去 培養(yǎng)液，無血清馴化24h，細胞周期同步化后，分別加入5.0μmol L-1 反義、無義寡核苷酸，繼續(xù)培養(yǎng)，48h后停止培養(yǎng)，0.01mol L-1 PBS（pH7.4）洗2次，2.5g L-1 胰酶消化后離心，以700mL L-1 的冷乙醇制成1×10
6 L-1 密度單細胞懸液，30min后，PI染色，流式細胞儀檢測.
統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)用x ±s表示，組間進行t檢驗，P
2 結(jié)果
2.1 寡核苷酸對VSMC增殖活力的影響 相同濃度（10μmol L-1 ）各種寡核苷酸對血管平滑肌作用24h后，各加藥組與空白對照組相比MTT A值無明顯差異（P>0.05），各加藥組之間也無明顯差異（P>0.05）;在加藥后48h反義組與空白組之間有顯著性差異（P0.05），5μmol L-1 以上濃度的PDGFR-βAODN對細胞有明顯增殖抑制作用，表明PDGFR-βAODN增殖抑制作用有明顯的濃度依賴效應(yīng).
表1 寡核苷酸對血管平滑肌細胞增殖的影響 略
2.2 PDGFRβAODN對細胞周期的影響 與空白對照組相比10μmol L-1 AODN作用于VSMC24h后細胞G1 期（DNA合成前期）比數(shù)分數(shù)達到0.70，而空白對照組G1 期細胞只占0.50明顯低于AODN組（P
2.3 PCNA免疫細胞化學(xué)染色 空白對照組PCNA染色呈強陽性（Fig1A）;5μmol L-1 PDGFR-βAODN作用于VSMC48h后細胞PCNA染色呈陽性;10μmol L-1 以上AODN作用于VSMC48h后細胞PCNA染色呈陰性（Fig1B），陽性率與對照組比較有明顯差異（P
圖1 PCNA染色 略
表2 不同寡核苷酸對血管平滑肌細胞PCNA表達的影響 略
表3 反義寡核苷酸濃度對血管平滑肌細胞PCNA表達的影響 略
3 討論
PDGF對VSMC是一種強烈的促增殖劑和趨化劑，并且PDGF對VSMC的作用有一定的組織特異性［6］ .當(dāng)大量PDGF和β型受體結(jié)合后通過絡(luò)氨酸激酶啟動細胞的增殖信號，最終導(dǎo)致VSMC大量增生和再狹窄的發(fā)生［7，8］ .PDGF的主要作用是使細胞從非分裂狀態(tài)的G1 期進入分裂周期，起著一種“獲能因子”（competence factor）的作用，其他生長因子如成纖維細胞生長因子（FGF）可以促進細胞從G1 期進入DNA合成期［9］ .反義寡核苷酸可以通過其特異的堿基序列與目的基因相結(jié)合阻止目的基因的表達［10］ .因此PDGFR-β反義寡核苷酸可以阻止VSMC的PDGFR-β蛋白的表達從而阻斷其與PDGF的結(jié)合，使細胞停留于G1 期，最終抑制VSMC的增殖.另外我們在實驗中發(fā)現(xiàn)PDGFR-βAODN作用于VSMC24h對VSMC無明顯增殖抑制作用，這與AODN雖被細胞攝取，但尚未能與目的基因達到充分結(jié)合等原因有關(guān);過去的研究證明PCNA是DNA復(fù)制和細胞分裂過程中DNA多聚酶最重要的輔助因子.PCNA位于細胞核內(nèi)，它的表達量與VSMC的增殖活力呈正相關(guān)［11］ .因此我們在實驗中以PCNA的表達強度側(cè)面反映VSMC的增殖活力，結(jié)果間接證明了PDGFR-βAODN對VSMC增殖抑制作用.另外也有少數(shù)人認為寡核苷酸的作用無需任何序列特異性，而是與各種生長因子或膜蛋白相結(jié)合，抑制細胞的遷移、增殖.這與目前大多數(shù)同仁的觀點不符，與本實驗的研究結(jié)果也不相符.我們發(fā)現(xiàn)正義寡核苷酸和錯義寡核苷酸對VSMC的增殖均無明顯抑制作用.這說明寡核苷酸對細胞的影響有嚴格的序列特異性.
PDGFR-βAODN作為基因工程和分子生物學(xué)的產(chǎn)物對體外培養(yǎng)VSMC的增殖可以產(chǎn)生很大程度的抑制，另外因為該反義寡核苷酸對于VSMC具有一定的組織特異性，所以PDGFR-βAODN有望能在體內(nèi)成功抑制血管損傷后VSMC的異常增生和再狹窄的形成.
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